鸡CⅡ的分离提取、生物学特性分析及其口服耐受对类风湿性关节炎干预的研究

来源 :江苏大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:nini863700
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以慢性滑膜炎症、关节软骨侵蚀为特征的自身免疫性疾病,发病机制未明。Ⅱ型胶原蛋白(typeⅡcollagen, CⅡ)是软骨基质的主要有机成分,由3条相同的α1(Ⅱ)链组成。近年来研究表明,类风湿性关节炎的发病与CⅡ诱导的自身免疫应答有关,在10%-30%的RA患者血清和关节滑液可检测到抗天然和变性CⅡ抗体,用CⅡ免疫某些动物可诱导出实验性关节炎,口服CⅡ诱导免疫耐受对类风湿性关节炎有显著的疗效。但是研究结果差别很大,在抗CⅡ自身抗体的产生和诱导免疫耐受的机制方面研究进展缓慢,极大地限制了CⅡ的临床实际应用。主要影响因素包括:(1)CⅡ的来源和提取方法;(2)CⅡ抗体检测条件;(3)CⅡ的生物学特性、消化酶对其的作用;(4)口服CⅡ的剂量、剂型和机体胃肠道黏膜的免疫状态等。在本研究中,我们通过选择分离条件,建立了从鸡胸箭突软骨中提取和纯化CⅡ的可靠方法,对CⅡ的生物学特性进行了系统分析;优化实验条件,建立了血清抗CⅡ抗体的ELISA检测法,并探讨其在类风湿性关节炎的应用价值;体外研究各种消化酶对CⅡ的水解片段,体内经口服观察机体特异性IgG、IgA、IgM抗体的产生水平和对派氏集合淋巴结细胞因子表达的影响,探讨口服CⅡ诱导免疫耐受的可能性和对类风湿性关节炎干预的可能机制。第一部分Ⅱ型胶原蛋白的提取和纯化目的:优化实验条件,建立提取和纯化Ⅱ型胶原蛋白的可靠方法。方法:选择鸡胸箭突软骨为提取原料,用盐酸胍去除蛋白多糖,对胃蛋白酶的消化方式、氯化钠盐析浓度、DEAE阴离子树脂种类进行研究,采用SDS-PAGE对CⅡ进行鉴定。结果:鸡胸箭突前处理方便,其软骨匀浆液主要含有CⅡ在内的4种蛋白质。4 mol/L盐酸胍能有效去除蛋白多糖;采用分步消化方式、控制反应温度在4℃、消化后的胶原蛋白溶液迅速调节到pH7.5等措施能获得满意的限制性酶解结果;氯化钠盐析浓度为2.4mol/L时最佳。SDS-PAGE电泳结果显示提取纯化的CⅡ与Sigma公司的产品一致,亚基分子量约为120kD。结论:改进后的方法具有材料广泛、实验条件简便、结果可靠等优点,适用于科研、临床等各种规模CⅡ的提取。第二部分Ⅱ型胶原蛋白的生物学特性研究目的:研究CⅡ的物理化学特性、抗体产生规律和免疫反应性。方法:用光谱法测定CⅡ吸收峰和等电点、HPLC法检测CⅡ氨基酸组成、乌氏黏度计测定不同条件下CⅡ溶液的增比黏度。SDS-PAGE法测定分子量,结合免疫印迹法分析CⅡ和热变性CⅡ(denatured typeⅡcollage, D-CⅡ)的免疫反应性。用CⅡ免疫新西兰白兔,每隔10天收集血清,以改良间接ELISA法检测抗CⅡ抗体效价。结果:SDS-PAGE电泳显示CⅡ有α、β和γ三条区带,都能与抗CⅡ抗体发生特异性反应,α亚基分子量约120kD;D-CⅡ含有10多条免疫印迹反应呈阳性的片段。CⅡ溶液的最大吸收峰为230nm,等电点pH值约6.25。氨基酸组成中,甘氨酸、脯氨酸和丙氨酸含量高,芳香族氨基酸低。CⅡ溶液的增比黏度随浓度的增加而增加,在25~45℃范围内随着温度的升高逐渐下降。Ⅱ型胶原蛋白免疫新西兰白兔后,经ELISA检测,在免疫的第10天抗体效价达1:3200,第20天升至1:204800;加强免疫后,第30天和第40天抗体效价分别达到1:409600和1:819200。结论:Ⅱ型胶原蛋白具有独特的理化性质,因富含脯氨酸故具有较强的免疫原性,免疫新西兰白兔后获得高效价的CⅡ血清。第三部分血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体检测法的建立与应用目的:建立血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体的ELISA检测法,探讨其在类风湿性关节炎诊断和治疗方面的应用价值。方法:以上述实验提取的鸡Ⅱ型胶原蛋白作为包被抗原,优化实验条件,建立抗Ⅱ型胶原蛋白抗体间接ELISA法。对289例RA病人和54例健康人血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体进行检测。结果:Ⅱ型胶原蛋白抗体ELISA检测法的条件为:先用0.05 mol/L醋酸将CⅡ配成0.5 g/L储存液,再用PH7.60.05 mol/L磷酸盐缓冲液将CⅡ配成20μg/ml的包被液,4℃12 h进行包被,继以10%羊血清、37℃2 h为封闭条件;用含10%羊血清的缓冲液分别将血清作1:50稀释、酶标抗体作1:2000稀释;采用双波长450nm/630 nm进行测定。采用建立的方法,发现RA患者和健康人血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体阳性率分别为19.38%和1.85%,两组有明显的统计学差异(P<0.01)。结论:CⅡ可以作为血清抗Ⅱ型胶原蛋白抗体ELISA法的包被抗原;用含10%羊血清的缓冲液对酶标反应板进行封闭和对血清标本、酶标抗体进行稀释,可以有效地阻止非特异性吸附,提高结果的重复性和特异性。抗Ⅱ型胶原蛋白抗体可作为判断RA患者病情的一个辅助诊断指标。第四部分消化酶对Ⅱ型胶原蛋白作用的体内外研究目的:体外观察消化酶对天然Ⅱ型胶原蛋白(native typeⅡcollage,N-CⅡ)和变性Ⅱ型胶原蛋白(D-CⅡ)的酶解作用;小鼠和大鼠胃肠道给予CⅡ探讨口服Ⅱ型胶原蛋白对类风湿性关节炎可能的干预机制。方法:在体外将胃蛋白酶、胰蛋白酶和α-糜蛋白酶分别作用于N-CⅡ和D-CⅡ,采用SDS-PAGE电泳和免疫印迹法分析酶解产物。将N-CⅡ和D-CⅡ注入鼠胃和十二指肠内,在不同时间收集胃和肠内容物,进行SDS-PAGE电泳分析。结果:CⅡ在胃、肠道能处于溶解状态。在体外,N-CⅡ在胃蛋白酶和糜蛋白酶作用下电泳和免疫印迹图谱无变化,而被胰蛋白酶作用后出现10条免疫印迹为阳性的条带;D-CⅡ易被上述消化酶分解。N-CⅡ不被胃内环境水解,可被肠道消化酶缓慢降解;D-CⅡ可被胃、肠道消化酶迅速分解。结论:N-CⅡ可被胰蛋白酶水解产生多条活性片段,但对胃内环境、胃蛋白酶和糜蛋白酶具有抵抗力;D-CⅡ易被胃、肠道消化酶水解。结果提示口服CⅡ诱导免疫耐受、治疗类风湿性关节炎可能与CⅡ特性和胰蛋白酶对其的作用有关。第五部分口服Ⅱ型胶原蛋白对血清抗体和派氏集合淋巴结细胞因子表达的影响目的:探讨口服Ⅱ型胶原蛋白对派[伊尔]氏集合淋巴结(PP结)的形态学、细胞因子表达水平和血清特异性IgG、IgA、IgM含量的影响。方法:连续10d给小鼠口服不同剂量的CⅡ,第11天和第21天用佐剂或CⅡ进行免疫,分别于第11天、第21天和第31天采集血液和PP结。PP结经HE染色后,镜下观察其增生的情况。用荧光实时定量RT-PCR法,检测PP结中IL-17、TNF-α、IFN-γ和TGF-β1 mRNA的水平。采用ELISA法检测血清抗CⅡIgG、IgA、IgM的水平。结果:口服CⅡ10d后,PP结增生活跃,高剂量组可见清晰的帽状结构;血清中出现IgA,未见IgG和IgM水平增加;IL-17、TNF-α、IFN-γmRNA的表达受到抑制。以CⅡ初次免疫后,实验组IgA、IgM、IL-17的水平均低于对照组(p<0.05或p<0.01),TGF-β1的水平显著增加(p<0.05)。以CⅡ加强免疫后,高剂量组IgA的水平显著增加(p<0.05),实验组IgM的水平仍受到抑制(p<0.05或p<0.01),TGF-β1的水平高于对照组(p<0.05)。以佐剂免疫时PP结中细胞因子的表达与CⅡ免疫时相似,未见血清抗CⅡIgG、IgA、IgM水平的变化。结论:口服CⅡ能使血清中产生特异性IgA,抑制PP结IL-17、TNF-α、IFN-γ的基因表达,对CⅡ免疫后IgA、IgM的产生和IL-17 mRNA的表达具有一定的抑制作用。血清特异性抗体的水平和细胞因子表达的变化的结果表明,口服CⅡ有助于诱导免疫耐受并干预类风湿性关节炎的发生发展,有着潜在的类风湿性关节炎防治作用。
其他文献
急性肺损伤(acutelunginjury,ALI)和急性呼吸窘迫综合征(acuterespiratorydistresssyndrome,ARDS)多发生于原心肺功能正常的患者,是由于心源性以外的各种肺内、肺外致病因素引起的以
降低工程项目施工成本成为建设企业发展壮大的必由之路,建设企业只有不断地完善成本管控,建立健全自身的成本控制措施,在规划前、施工中、运营后全方面、全方位地控制整个建
湖北宜化化工股份有限公司是全国520家重点企业之一,总资产65亿元。经过近三十年的发展,公司已由年产一万吨合成氨的小厂发展成现在煤化工、磷化工、盐化工三足鼎立的大型企业
基于磁流变技术的汽车减振器是汽车悬架技术提升为半主动控制的关键结构,其模型的建立与分析对于预测减振器特性具有重要作用。文章通过环形流动模式的减振器理论分析模型,建
ue*M#’#dkB4##8#”专利申请号:00109“7公开号:1278062申请日:00.06.23公开日:00.12.27申请人地址:(100084川C京市海淀区清华园申请人:清华大学发明人:隋森芳文摘:本发明属于生物技
中医(中西医结合)临床实践指南的制定需要耗费大量的人力、物力和财力。指南制定者需要检索获取与评价已有证据,并评估是否需要和如何制作新的系统评价。文章介绍了从已有指南
<正>信号素(semaphorins,Sema)是一类在神经系统发育过程中发现的神经导向因子[1]。研究发现信号素家族至少含有20个成员,它们发挥着不同的生物学功能,如心脏发生、血管发生[
种猪挑选是项极其重要的工作,常通过肉眼观察来挑选种猪。这种挑选种猪的方法既快速又实用。由于这种方法操作简易,同时效果比较可靠,而被广大饲养者采用。笔者根据所学的知识及
期刊
目的:比较经尿道前列腺电切剜除术(TUERP)与耻骨上前列腺切除术(SP)治疗大体积前列腺增生患者的临床效果。方法:回顾性分析我院2005年7月至2014年1月行手术治疗的141例大体积前列腺
[概述]藿香又名土藿香,为唇形科藿香属,多年生宿根草本植物藿香[Agastahe(rugosa(FischetMey)Kuntze],以全草入药,性能解暑化湿,行气和胃,可治中暑发热、头痛胸闷、恶心呕吐