目前对于恶性肿瘤的治疗，传统的手段包括手术治疗、放疗、化疗等都难以达到预期的效果。近年来，随着基因工程技术的高速发展，抗体在恶性肿瘤的诊断、治疗上日益成为研究的热点。单链抗体(ScFv)因其具有抗原结合活性、分子量小、穿透力强、体内循环半衰期短及排除了Fc段所致的免疫复合物反应等优点，而成为新型的肿瘤治疗靶向载体，在基因工程抗体研究领域中显示出广阔的前景。鱼精蛋白被证实是一种具有很强的DNA结合能力的强碱性蛋白[1,2]。但鱼精蛋白分子量较大，且组织穿透性差，目前大多研究主要集中在既具有DNA结合能力同时分子量又相对较小的鱼精蛋白截短体(tP)上。本研究的目的在于将人源化抗HER2的ScFv与tp利用重组的方法，构建出既能识别肿瘤细胞表面特异性结合位点，有具有核酸结合能力的双功能融合蛋白(ScFv/tP)，并对该融合蛋白的功能进行鉴定研究；同时为开发出依赖抗体介导的肿瘤靶向治疗药物提供平台基础。实验一：目的：构建抗HER2的ScFv/tP融合基因方法：以携带相应酶切位点的pcDNA3.1-His6-H520C9ScFv质粒为模版，通过PCR扩增，再用限制性内切酶Hind III和EcoR I双酶切pcDNA3.1-His6-H520C9ScFv，经电泳、纯化后获得ScFv。人工合成两条（正向和反向）编码22个氨基酸的鱼精蛋白缩短体序列的寡核苷酸，并在寡核苷酸链的两端引入带有EcoR I及Xho I酶切位点的粘端序列。将两条tp经缓慢退火后，与经Hind III和EcoR I双酶切得到的ScFv cDNA片段一起联接，插入经Hind III和Xho I双酶切的真核表达载体pcDNA3.1-His6中，获得人源化抗HER2的pcDNA3.1-His6-H520C9ScFv/tp真核表达载体。将所得到的质粒转化感受态大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，进行Hind III和Xho I双酶切鉴定、琼脂糖凝胶电泳鉴定并测序。结果及结论：经过双酶切鉴定以及测定序列证实：所扩增的目的基因序列正确，成功构建出含人源化抗HER2的质粒pcDNA3.1-His6—H520C9ScFv/tP真核表达载体。实验二：目的：ScFv/tp融合蛋白的表达以及纯化方法：通过脂质体转染的方法，将重组pcDNA3.1-His6-H520C9ScFv/tP真核表达载体导入293细胞，并用G418筛选转染后的细胞，以获得稳定表达ScFv/tP融合蛋白的293细胞体系。将筛选得到的高表达的293细胞大量培养，提取后以获得大量的ScFv/tP融合蛋白，并通过Western-blot检测该融合蛋白在293细胞中的表达情况，利用His标签，通过镍柱亲和层析纯化目标蛋白。结果及结论：经Western-blot检测证实转染重组质粒的293细胞中能表达含有His标签的ScFv/tP融合蛋白，经SDS-PAGE鉴定证实所获得的ScFv/tP融合蛋白大小与预计大小一致，约36kDa。实验三：目的：ScFv/tP融合蛋白的活性分析及DNA结合能力研究方法：选用HER2阳性的人卵巢癌SKOV-3ip1细胞，HER2阴性的人肝癌SMMC-7721细胞来检测ScFv/tP融合蛋白的靶向性。间接免疫荧光检测人卵巢癌SKOV-3ip1细胞，人肝癌SMMC-7721细胞对ScFv/tP融合蛋白的内吞效果；凝胶迁移阻滞试验检测ScFv/tP融合蛋白与DNA结合活性；ELISA检测融合蛋白与抗原的结合活性；流式细胞技术检测外源DNA与ScFv/tP融合蛋白结合的最佳比例；荧光倒置显微镜观察融合蛋白运转外源DNA的情况。结果：间接免疫荧光检测提示ScFv/tP融合蛋白可内化进入人卵巢癌细胞SKOV-3ip1，但不能内化进入人肝癌细胞SMMC-7721；凝胶迁移阻滞实验提示ScFv/tP融合蛋白具有DNA结合活性；ELISA提示融合蛋白能与细胞表面的HER2抗原特异性结合；荧光显微镜观察ScFv/tP融合蛋白对外源DNA的靶向运转情况。讨论：ScFv/tP融合蛋白能够被人卵巢癌细胞内化进入细胞内，而不能被HER2阴性的人肝癌细胞所内化；ScFv/tP融合蛋白既具有靶向性结合HER2阳性的人卵巢癌细胞，又具有DNA结合活性；融合蛋白与外源DNA在最佳混合摩尔比例下转染人卵巢癌细胞，能获得较高的转染率；ScFv/tP融合蛋白能够将外源DNA的运输入人卵巢癌细胞，而不能传递入HER2阴性的人肝癌细胞。