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杆状病毒是一类节肢动物特异的环状双链DNA病毒,该病毒的包膜蛋白是病毒重要的结构蛋白,这一结构蛋白对于介导病毒侵入起重要作用,同时还可能影响病毒的宿主范围。小菜蛾颗粒体病毒(Plutella xylostella Granulovirus,PlxyGV)是小菜蛾的主要致病病毒,农业上主要用于生物防治杀虫剂。同其他Ⅱ组NPV及黄地老虎颗粒体病毒(Agrotis segetum Granulovirus,AgseGV)类似,PlxyGV的基因组中也没有gp64的同源基因,但发现其orf26(Px26)的预期编码产物与AgseGV的F蛋白(AgseF)同源,二者具有较高序列相似度。最近有研究报道显示,AgseGV f基因能够功能性替代苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)的gp64基因,而且具有低pH诱导的膜融合功能。为了试图探讨Px26基因的功能属性及其预期编码产物在转染昆虫细胞内的定位,本文首先通过构建含有egfp(质粒pIE-egfp)、Px26(质粒pIE-Px26)和Px26-egfp(质粒pIE-Px26-egfp)融合基因的瞬时表达质粒及对照质粒pLd130-egfp对多种昆虫传代细胞系进行转染。实验结果表明:当用质粒pIE-egfp转染细胞后,发现绿色荧光都布满整个细胞,将pH由6.0降至5.0时无多核细胞形成;而用质粒pLd130-egfp转染细胞后部分细胞充满荧光,部分细胞只在其膜上有荧光分布,将培养基pH由6.0降至5.0时,被转染的细胞出现多核细胞或合胞体;用pIE-Px26-egfp质粒转染的细胞pH由6.0到5.0时,荧光有的分布于膜上,有的分布于整个细胞,但无合胞体出现。此外,对比pIE-Px26-egfp、pIE-Px26与pLd130-egfp质粒转染的细胞,进一步说明Px26预期编码产物不能促使转染细胞的细胞膜融合。然而,用上述质粒转染Bm-21E-HNU5和SL-1细胞时的现象相同,由于LD130-EGFP及Px26-EGFP这两种融合蛋白在这两种细胞系中的表达量都较低,因而,在低pH诱导下都未发现被转染细胞的细胞膜有融合的现象。此外,为了排除pH对实验造成的影响,实验时还分别用不同pH培养基作用于转染的细胞(pH 3.0或4.0;pH 7.0或7.2),发现用质粒pIE-Px26-egfp及pIE-Px26转染的细胞仍无多核细胞现象出现,而且这种不融合现象与转染细胞的类型及培养基的pH无关。其次,通过利用Lamda-Red重组系统对AcMNPV的Bacmid进行gp64基因敲除,为下一步回复敲除研究未知膜融合基因的功能打下基础。Lamda-Red重组系统最初主要被用于大肠杆菌基因组的研究。近年来随着杆状病毒穿梭载体的开发成功,使得该重组系统已成为研究杆状病毒基因功能的有力工具。本文的第二部分则是用Lamda-Red重组系统对AcMNPV的Bacmid进行gp64基因敲除,获得缺失该基因的重组Bacmid,通过转染-感染实验验证,初步构建一表达EGFP的重组病毒。为深入研究Px26基因及其它外源基因回复敲除鉴定基因功能奠定基础,该项工作正在进行之中。