研究背景:缺血性心脏病正在成为人类健康的头号公敌,以肥胖为主要表现、以糖类、脂肪代谢异常为主要特征的一系列病理变化是导致缺血性心脏病的最常见原因。第一时间恢复缺血心肌的血液供应被认为是治疗缺血性心脏病的关键,然而这个过程必然伴随着进一步的心肌损伤,即缺血/再灌注损伤。缺血/再灌注损伤是冠心病等以缺血为主要病理变化的心脏病患者和接受体外循环下心脏手术患者近期和远期疗效欠佳的一个重要原因,抗心肌缺血/再灌注损伤多年来一直是心肌保护研究领域的焦点,研究心肌缺血/再灌注损伤及其分子机制具有巨大的潜在治疗价值。近年来研究发现除了作为存储能量的场所,脂肪细胞还具备分泌功能。脂肪细胞能够分泌多达数十种具有生物学活性的小分子,称为脂肪细胞因子。在这些脂肪细胞因子中,脂联素是研究较为充分的一员。它在调节糖代谢、介导炎症反应中具有重要作用,并参与介导心肌缺血/再灌注损伤。外源性脂联素可以有效减轻缺血/再灌注损伤引起的实验动物心肌梗死面积,并显著改善缺血/再灌注损伤后心脏泵血功能,然而其作用在肥胖/2型糖尿病状态下受到不同程度的抑制,即脂联素抵抗。在研究这一现象的过程中,C1q/TNF-related proteins家族蛋白被相继发现。CTRP9在心脏表达量远远超过脂联素,且受到肥胖/2型糖尿病等因素的负性调节。我们的研究组前期研究首先发现,CTRP9具有内皮依赖的血管扩张作用,并且首先发现CTRP9显著改善心肌梗死后心室重塑,但是其分子机制,尤其是在肥胖/2型糖尿病情况下的心肌保护作用及其分子机制尚待深入研究。内质网应激参与胰岛素抵抗、2型糖尿病、动脉硬化及冠心病的发病,介导心脏缺血/再灌注损伤,但是内质网应激是否参与CTRP9抗心肌缺血/再灌注损伤作用尚未有报道。研究目的:CTRP9对正常及糖尿病大鼠心脏心肌缺血/再灌注损伤的保护作用及其分子机制。研究方法:第一部分:不同浓度CTRP9对正常大鼠离体心脏缺血/再灌注损伤的保护作用研究。使用离体心脏灌注实验观察不同浓度CTRP9对正常大鼠离体心脏缺血/再灌注损伤的保护作用。根据所使用的CTRP9浓度不同,实验分为4组:○1 Vehicle(阴性对照组);○2 CTRP9 0.3μg;○3 CTRP9 1μg;○4 CTRP9 3μg。离体心脏平衡30min,按照各自分组把不同剂量的CTRP9溶于1ml KH缓冲液中,通过灌流装置位于心脏上方的侧孔加入到灌流液中,Vehicle组加入等量KH缓冲液。首先关闭位于心脏上方的阀门,使离体心脏缺血30 min,然后打开阀门再灌注60 min。离体心脏缺血/再灌注过程中实时监测并采集心率、冠状动脉流量、左心室发展压、左心室压力变化率最大值等反应心脏功能的血流动力学指标,并计算心率压力乘积。再灌注过程中定时收集冠脉流出液。离体心脏再灌注结束后检测冠脉流出液中反应心肌损伤的标志物乳酸脱氢酶的活性水平,使用心脏大体标本切片检测心肌梗死面积,使用心肌冰冻超薄切片检测心肌细胞细胞凋亡比率,一部分心肌组织立即冻存于-80℃冰箱以检测凋亡蛋白Caspase-3、内质网伴侣分子DsbA-L、内质网应激标志物CHOP和GRP-78表达水平。第二部分:内质网应激在CTRP9抗心肌细胞缺氧/复氧损伤中的作用研究。细胞培养建立大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤模型,使用毒胡萝卜素处理建立大鼠心肌细胞内质网应激模型,按照细胞模型不同及处理不同,实验分为4组:○1 H/R;○2 H/R+TG;○3 H/R+CTRP9;○4 H/R+TG+CTRP9。毒胡萝卜素(0.01μmol/l)处理48h后,CTRP9(1μg/ml)处理大鼠心肌细胞24h,然后予以缺氧/复氧。缺氧/复氧后检测心肌细胞活力,制作心肌细胞爬片检测心肌细胞凋亡比率,并检测培养液中乳酸脱氢酶活性水平,部分细胞冻存后提取蛋白以检测凋亡蛋白Caspase-3、内质网应激相关蛋白CHOP、GRP-78和内质网伴侣分子DsbA-L表达水平。第三部分:DsbA-L在CTRP9抗心肌细胞缺氧/复氧损伤中的作用研究。细胞培养建立大鼠心肌细胞缺氧/复氧模型,使用DsbA-L小干扰RNA建立低表达DsbA-L的大鼠心肌细胞模型,按照细胞模型不同及处理不同,实验分为4组:○1 Scramble(阴性对照组);○2 DsbA-L siRNA;○3 Scramble+CTRP9;○4 DsbA-L siRNA+CTRP9。DsbA-L siRNA转染后孵育48h,CTRP9(1μg/ml)处理24h,然后予以缺氧/复氧。缺氧/复氧后检测心肌细胞活力,制作心肌细胞爬片检测心肌细胞凋亡比率,并检测培养液中乳酸脱氢酶活性水平,部分细胞冻存后提取蛋白以检测凋亡蛋白Caspase-3、内质网应激相关蛋白CHOP、GRP-78和内质网伴侣分子DsbA-L表达水平。第四部分:CTRP9对2型糖尿病大鼠离体心脏缺血/再灌注损伤的保护作用及分子机制研究通过高脂饮食和注射链脲佐菌素诱导建立2型糖尿病大鼠模型,使用离体心脏灌注实验观察CTRP9(1μg/ml)对离体心脏缺血/再灌注损伤的保护作用。根据第一部分实验结果,按照在体动物模型和离体心脏灌流实验处理不同,实验分为4组:○1 Normal;○2 Diabetic;○3 Normal+CTRP9;○4 Diabetic+CTRP9。离体心脏平衡30min,按照各自分组把重组CTRP9(1μg)溶于1ml KH缓冲液中,或把等量的KH缓冲液通过灌流装置位于心脏上方的侧孔加入到灌流液中。首先关闭位于心脏上方的阀门,使离体心脏缺血30 min,然后打开阀门再灌注60 min。离体心脏缺血/再灌注过程中实时监测并采集心率、冠状动脉流量、左心室发展压、左心室压力变化率最大值等反应心脏功能的血流动力学指标,并计算心率压力乘积。再灌注过程中定时收集冠脉流出液。离体心脏再灌注结束后检测冠脉流出液中反应心肌损伤的标志物乳酸脱氢酶的活性水平,使用心脏大体标本切片检测心肌梗死面积,使用心肌冰冻超薄切片检测心肌细胞细胞凋亡比率,一部分心肌组织立即冻存于-80℃冰箱以检测凋亡蛋白Caspase-3、内质网伴侣分子DsbA-L、内质网应激标志物CHOP和GRP-78表达水平。研究结果:第一部分:不同浓度CTRP9对正常大鼠离体心脏缺血/再灌注损伤的保护作用研究。离体心脏灌流实验发现,CTRP9浓度为0.3μg/ml时除明显改善再灌注后冠脉流量外,没有明显的抗心肌缺血/再灌注损伤保护作用,表现为与Vehicle组相比,CTRP9 0.3μg组再灌注后HR,LVDP,+dP/dt和RPP等血流动力学指标和冠脉流出液中LDH活性水平、心肌梗死面积、心肌细胞凋亡比率和凋亡蛋白Caspase-3表达水平等心肌损伤指标没有明显改变。增加CTRP9浓度为1μg/ml时,具有较好的抗离体心脏缺血/再灌注损伤保护作用,表现为与Vehicle相比,CTRP9 1μg组再灌注后HR,LVDP,+dP/dt和RPP等血流动力学指标显著改善,冠脉流出液中LDH活性水平、心肌梗死面积、心肌细胞凋亡比率和凋亡蛋白Caspase-3表达水平等心肌损伤指标明显降低。而进一步增加增加CTRP9浓度为3μg/ml时,并不能发挥进一步的抗缺血/再灌注损伤保护作用,表现为与CTRP9 1μg组相比,CTRP9 3μg组再灌注后HR,LVDP,+dP/dt和RPP等血流动力学指标和冠脉流出液中LDH活性水平、心肌梗死面积、心肌细胞凋亡比率和凋亡蛋白Caspase-3表达水平等心肌损伤指标无明显变化。Western blot检测发现,CTRP9浓度为1和3μg/ml时明显减轻内质网应激,表现为与Vehicle组和CTRP9 0.3μg相比,CTRP9 1μg和CTRP9 3μg组再灌注后内质网应激标志物CHOP和GRP-78表达水平显著降低。第二部分:内质网应激在CTRP9抗心肌细胞缺氧/复氧损伤中的作用研究。通过心肌细胞培养和缺氧/复氧损伤模型研究发现,TG处理降低大鼠心肌细胞内质网伴侣分子DsbA-L表达水平,增加内质网应激,加重缺氧/复氧损伤,表现为与H/R组相比,H/R+TG组缺氧/复氧损伤后DsbA-L表达水平显著下降,内质网应激标志物CHOP和GRP-78表达水平显著增加,心肌细胞活力下降,心肌细胞凋亡比率,培养液中LDH活性水平和凋亡蛋白Caspase-3表达水平等细胞损伤指标显著增高。CTRP9部分逆转TG引起的DsbA-L表达下调,减轻TG引起的内质网应激,减轻缺氧/复氧损伤,表现为与H/R+TG组相比,H/R+TG+CTRP9组缺氧/复氧损伤后DsbA-L表达水平显著增加,内质网应激标志物CHOP和GRP-78表达水平显著降低,心肌细胞活力增加,心肌细胞凋亡比率,培养液中LDH活性水平和凋亡蛋白Caspase-3表达水平等细胞损伤指标显著降低;而与H/R+CTRP9组相比,H/R+TG+CTRP9组缺氧/复氧损伤后DsbA-L表达水平显著降低,内质网应激标志物CHOP和GRP-78表达水平显著增加,心肌细胞活力下降,心肌细胞凋亡比率,培养液中LDH活性水平和凋亡蛋白Caspase-3表达水平等细胞损伤指标显著增高。第三部分:DsbA-L在CTRP9抗心肌细胞缺氧/复氧损伤中的作用研究。通过心肌细胞培养和缺氧/复氧模型研究发现,DsbA-L-siRNA降低大鼠心肌细胞内质网伴侣分子DsbA-L表达水平,增加内质网应激,加重缺氧/复氧损伤,表现为与Scramble组相比,DsbA-L siRNA组缺氧/复氧损伤后内质网应激标志物CHOP和GRP-78表达水平显著增加,心肌细胞活力降低,心肌细胞凋亡比率,培养液中LDH活性水平和凋亡蛋白Caspase-3表达水平等细胞损伤指标显著增高。CTRP9明显增加DsbA-L表达水平,减轻Dsb A-L-siRNA引起的内质网应激,减轻缺氧/复氧损伤,表现为表现为与DsbA-L siRNA组相比,DsbA-L siRNA+CTRP9组缺氧/复氧损伤后DsbA-L表达水平显著增加,内质网应激标志物CHOP和GRP-78表达水平显著降低,心肌细胞活力增加,心肌细胞凋亡比率,培养液中LDH活性水平和凋亡蛋白Caspase-3表达水平等细胞损伤指标显著降低;而与Scramble+CTRP9组相比,DsbA-L siRNA+CTRP9组缺氧/复氧损伤后DsbA-L表达水平显著降低,内质网应激标志物CHOP和GRP-78表达水平显著增加,心肌细胞活力增加,心肌细胞凋亡比率,培养液中LDH活性水平和凋亡蛋白Caspase-3表达水平等细胞损伤指标显著增高。第四部分:CTRP9对2型糖尿病大鼠离体心脏缺血/再灌注损伤的保护作用及分子机制研究通过建立在体2型糖尿病大鼠模型和离体心脏灌流实验发现,2型糖尿病减少心肌细胞内质网伴侣分子Dsb A-L表达水平,激活内质网应激,加重缺血/再灌注损伤,表现为与Normal组相比,Diabetic组再灌注后CF,LVDP,+dP/dt和RPP等血流动力学指标明显降低,心肌细胞凋亡比率、心肌细胞Caspase-3表达水平、心肌梗死面积和冠脉流出液中LDH活性水平等心肌损伤指标明显增加。CTRP9增加2型糖尿病心脏Dsb A-L表达水平,缓解2型糖尿病引起的内质网应激,减轻缺血/再灌注损伤,表现为与Diabetic组相比,Diabetic+CTRP9组再灌注后CF,LVDP,+dP/dt和RPP等血流动力学指标明显改善,心肌细胞凋亡比率、心肌细胞Caspase-3表达水平、心肌梗死面积和冠脉流出液中LDH活性水平等心肌损伤指标明显降低。研究结论:1.CTRP9 1μg/ml和3μg/ml时具有较好的保护大鼠离体心脏缺血/再灌注损伤作用。2.毒胡萝卜素降低大鼠心肌细胞内质网伴侣分子Dsb A-L表达水平,增加内质网应激标志物CHOP和GRP-78表达水平,加重缺氧/复氧损伤;CTRP9可以增加Dsb A-L表达水平,降低CHOP和GRP-78水平,起到心肌缺血/再灌注损伤保护作用;Dsb A-L si RNA增加CHOP和GRP-78表达水平,拮抗CTRP9缺氧/复氧损伤保护作用。提示CTRP9通过Dsb A-L发挥抗缺氧/复氧损伤保护作用。3.2型糖尿病降低心肌细胞Dsb A-L表达水平,增加CHOP和GRP-78水平,加重心肌缺血/再灌注损伤;CTRP9增加2型糖尿病心肌细胞Dsb A-L表达水平,降低CHOP和GRP-78水平,保护2型糖尿病心肌缺血/再灌注损伤。