血栓性疾病是一类严重危害人类健康和生命的疾病,可累及全身各个器官及系统,目前利用溶栓药物成为治疗此类疾病的主要方法。溶栓药物经过不断研究已发展到第三代,其中以重组人纤溶酶原激活剂(r-tPA)作为治疗人类血栓性疾病的新型药物。重组人组织纤溶酶原激活剂与天然t-PA具有相似的生物学活性,更具有溶栓能力强、与纤维蛋白亲和力高、全身出血副作用小、半衰期长、总使用剂量少等特点。作为第三代溶栓药物的新型代表,重组人纤溶酶原激活剂越来越受到血栓病患者的青睐,具有广阔的应用前景。外源基因在转基因纯合子动物的整合拷贝数是转基因半合子动物的两倍。本研究旨在筛选出转rhPA基因纯合子兔,比较外源基因rhPA在转基因纯合子兔和转基因半合子兔乳腺中的表达水平,探索在整合位点相同时,rhPA在转基因兔乳腺中的表达量与其拷贝数之间的关系。筛选高水平表达的转基因纯合子兔,培育用于生物制药的rhPA的转基因纯合子兔品系,为以后大规模制备溶血栓生物药品建立基础,并且用于药理学和生物学活性分析,有利于后期药品开发应用。本研究应用已经构建的乳腺特异表达载体PCL25/rhPA,通过原核期受精卵显微注射制备转rhPA基因家兔。经过PCR整合检测和ELISA表达检测筛选出原代转基因表达兔。F1代转基因表达兔兄妹同胞交配或回交获得F2代转基因兔,通过对F2代转基因兔测交筛选出其中的转基因纯合子兔。ELISA检测比较转基因纯合子兔与半合子兔乳清中rhPA的表达水平。实验以成年新西兰母兔为实验动物,将rhPA基因片段通过显微注射导入受精卵,移植受体64只,其中46只怀孕,出生仔兔207只,PCR整合阳性兔56只,存活37只。妊娠率为71.9%,阳性整合率为27.1%。ELISA检测37只转基因兔(或后代)乳汁,其中12只兔乳腺特异性表达rhPA。获得的rhPA基因表达公兔K29与正常新西兰母兔交配,共获得了F1代仔兔25只,经PCR检测筛选出F1代转基因兔16只,其中母兔10只,公兔6只。从F1代转基因兔中挑选公兔和母兔同胞交配,共获得F2代仔兔10只,经PCR检测筛选出F2代转基因兔5只,其中母兔4只,公兔1只。将F2代转基因兔再与正常兔测交配种,通过对后代的PCR检测,筛选出F2代中转基因纯合子兔。我们从F2代转基因兔中筛选出2只雌性转rhPA基因纯合子兔(编号K29 F2-05和K29 F2-09)。通过对K29 F2-09奶样的ELISA检测,发现其乳汁中重组人纤溶酶原激活剂(rhPA)的表达水平明显高于半合子转基因兔。本研究获得了乳腺特异性表达转基因兔,建立了PCL25/rhPA转基因兔基本繁殖群(K29系),并培育筛选出2只转rhPA基因纯合了母兔(编号K29 F2-05和K29 F2-09),经ELISA检测结果显示K29 F2-09母兔奶样中的rhPA表达量明显高于转rhPA基因半合子兔。实验研究结果证明PCL25/rhPA在转基因纯合子兔乳腺中的表达量高于转基因半合子兔的表达量。本研究验证了以培育转基因纯合子动物来提高外源基因表达量的可行性,为建立PCL25/rhPA转基因纯合子兔新品系做好铺垫,更为大量研制新型溶栓制剂奠定了基础。