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研究背景:肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)是各种致病因子作用于肝脏致其发生慢性损伤-修复的动态过程,其病理生理过程涉及分子水平、细胞水平及细胞外环境等多个层次,发生机制极其复杂,其中以肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)的激活最为关键。活化的HSC表达α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)同时分泌大量以Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)蛋白为主的细胞外基质(extracellular matrix,ECM),ECM合成与降解失衡导致大量ECM沉积在肝脏,最终发展为肝纤维化。近年来研究发现肝纤维化,甚至早期肝硬化是可逆转的。第10号染色体丢失与张力蛋白同源的磷酸酶基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)是人类最早发现的一个具有蛋白磷酸酶和脂质磷酸酶双重活性的肿瘤抑制基因。近年来有研究表明,在纤维化疾病中PTEN也发挥重要作用。导师课题组长期致力于肝纤维化机制的研究,前期研究已证实PTEN在小动物大鼠纤维化肝组织中发挥负性调控作用,那么PTEN是否参与大动物比格犬肝纤维化的发生呢?目前尚未见文献报道。因此,本课题设计以大动物比格犬为研究对象,通过皮下注射硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)构建肝纤维化模型,观察肝组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)、PTEN蛋白的表达情况。目的:通过观察PTEN在TAA诱导的比格犬纤维化肝组织中的表达变化,探讨PTEN是否参与大动物肝纤维化的发生。方法:12只健康清洁雄性比格犬,8月龄,体重(10±1)kg,随机分为2组,每组6只。正常对照组:正常饲养12周,不做特殊处理;TAA模型组:皮下注射TAA,12mg/kg,2次/周,持续12周。全部比格犬于12周末禁食后行1.5%戊巴比妥钠静脉麻醉,取肝左叶进行10%中性甲醛固定,常规梯度酒精脱水、石蜡包埋并切片。行HE染色和Masson染色观察肝组织病理形态改变及胶原纤维形成情况。用免疫组织化学染色检测比格犬肝组织中α-SMA、CollagenⅠ、PTEN蛋白的表达和分布。结果:(1)HE染色和Masson三色染色结果显示:正常对照组比格犬肝组织中肝细胞饱满,细胞条索排列规整,肝小叶结构正常;TAA模型组大部分肝细胞胞质疏松呈空泡状,部分肝细胞坏死,并伴有大量炎性细胞浸润,结缔组织增生形成纤维间隔,导致正常的肝小叶结构遭到破坏。(2)Masson三色染色图像分析结果显示:与正常对照组相比,TAA模型组肝组织胶原含量明显增高,有统计学意义(6.47%±1.32%vs 1.23%±0.21%,P<0.01)。(3)免疫组织化学染色显示:①α-SMA在正常对照组肝组织中仅少量表达于血管壁,染色较淡,呈浅黄色;而在TAA模型组肝组织中,α-SMA主要在门静脉、汇管区、纤维间隔处表达,呈棕黄色。②CollagenⅠ在正常对照组肝组织中分布于中央静脉壁,汇管区的血管壁、胆管壁,少量见于肝窦,呈丝状浅黄色;在TAA模型组肝组织中CollagenⅠ明显增多,主要表达于汇管区周围、纤维间隔区和少量肝窦,颜色加深,呈棕黄色颗粒。③PTEN在正常对照组比格犬肝组织中表达广泛,主要在细胞质表达,少量存在于胞核中;而在TAA模型组肝组织中PTEN表达减少,主要分布于纤维间隔、汇管区和增生的胆管周围细胞处。(4)免疫组织化学染色图像分析结果显示:与正常对照组相比,TAA模型组肝组织中CollagenⅠ和α-SMA表达均明显增加,有统计学意义(CollagenⅠ:2.11±0.51vs 0.12±0.03,P<0.01;α-SMA:2.35±0.65 vs 0.32±0.13,P<0.01);PTEN的表达显著降低,有统计学意义(5.16±0.73 vs 0.30±0.07,P<0.01)。(5)α-SMA与CollagenⅠ、PTEN相关性分析表明:在比格犬纤维化肝组织中,α-SMA的表达与CollagenⅠ的表达呈正相关关系(r=0.79),而与PTEN蛋白的表达呈负相关关系(r=-0.75),均有统计学意义(P<0.01)。结论:PTEN在TAA诱导的比格犬纤维化肝组织中表达下调,提示PTEN蛋白可能参与大动物比格犬肝纤维化的发生。