糖尿病肾损伤(DiabeticNephropathy)是糖尿病主要的微血管并发症，是导致终末期肾衰竭的主要原因。P38MAPK是MAPK家族的一员，同JNK一起属于应激活化蛋白。P38MAPK可以被多种应激因素所激活，如高血糖、高渗透压、氧化应激、以及一些炎症因子等。激活后的P38MAPK可以诱导细胞增殖、分化和凋亡。糖尿病状态下蛋白质非酶糖化、多元醇通路激活、二酰基甘油PKC通路激活及氧化应激等因素都可激活P38MAPK，进而磷酸化转录因子，调节基因表达，参与DN的发生与发展。体外研究表明：高血糖可以激活肾细胞的P38MAPK信号通路，诱导肾小球系膜细胞P38MAPK的磷酸化，使肾脏细胞外基质如纤维连接蛋白FN等表达增多。因此，有学者认为：P38MAPK是高糖引起糖尿病肾损伤的信号传递子，抑制P38MAPK通路的激活，可以减少肾小球系膜区细胞外基质的形成，减轻肾纤维化，阻止或减缓糖尿病肾损伤的发生与发展。大黄素(1、3、8-三羟基-6甲基蒽醌)是中药大黄抗糖尿病肾病、保护肾功能的主要活性成分。大黄素能以剂量依赖方式抑制成纤维细胞和肾小球系膜细胞的增殖，其机制是抑制细胞从G1期进入S期。大黄素可以通过调节c-myc基因的表达促进细胞的凋亡、抑制间质纤维化。大黄素产生这些作用的机理不明，目前还未见有相关的报道。既往的研究发现，在糖尿病状态下，大黄素无明显的降血糖作用，表明它抗糖尿病肾损伤的作用与血糖水平无关。有研究表明，部分糖尿病病人的血糖即使控制在正常范围，糖尿病肾损伤仍持续发生、发展，可见高血糖并不是引起糖尿病肾损伤的唯一因素。通过计算机药物分子设计分析，我们发现大黄素分子能够与P38MAPK空间三维结构的疏水基团结合，提示大黄素可能直接作用于P38MAPK。因此，我们推测大黄素抗糖尿病肾损伤、保护肾功能的作用可能与其抑制P38MAPK信号通路的激活有关。本实验在链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病肾损伤大鼠模型上，观察大黄素对糖尿病肾损伤大鼠肾功能的保护作用；并通过测定大黄素对肾组织磷酸化P38MAPK、核转录因子—磷酸化应答元件结合蛋白(CREB)及肾小球系膜外基质(ECM)的主要成分--纤维连接蛋白(FN)的影响，探讨大黄素对P38MAPK信号转导通路的影响及其抗糖尿病大鼠肾损伤的作用机制。 材料和方法 30只wistar大鼠，体重250±20g,随机分为3组：正常组、模型组、大黄素组，每组10只，大鼠禁食6小时后，模型组和大黄素组按60mg/Kg.BW的剂量单次腹腔注射STZ，正常对照组注射等体积枸橼酸缓冲液，72h后大鼠禁食6小时，尾静脉取血，测定血糖，血糖≥16.7mmol/L为造模成功。模型成功次日，大黄素组按40mg/kg的剂量灌胃给药，模型对照组及正常对照组均灌胃给予等体积的0.5％醋酸纤维钠溶液。实验第12周时，收集标本进行检测，血糖用葡萄糖氧化酶法检测，BUN、Scr分别用酶法、速率法由BeckmanCX-5全自动生化分析仪进行检测,UPE测定用磺基水杨酸—硫酸钠比浊法。常规方法制备石腊切片，作HE染色，应用HPIAS-2000高清晰度彩色病理图像分析系统6.0测定肾小球平均面积(HCPA)、平均体积(MCV)。免疫组化检测磷酸化P38，磷酸化CREB在肾脏的定位表达，western-blot检测肾脏总P38，磷酸化P38，磷酸化CREB，及纤维连接蛋白的半定量表达。 结果 一：大黄素对STZ糖尿病肾损伤大鼠肾功能相关指标的变化影响：与正常对照组相比，实验第12周时模型对照组体质量明显下降，肾质量明显增加，肥大指数(肾重/体重)增加，肾小球面积、肾小球体积明显增加，血糖、24小时尿蛋白、血肌酐、尿素氮等也明显升高(P均＜0.05)，提示糖尿病肾损伤大鼠模型成功；大黄素组的肾重、肥大指数、肾小球面积、肾小球体积、24小时尿蛋白、血肌酐、尿素氮等与糖尿病模型组相比明显降低(P均＜0.05)，而血糖与模型组相比，虽有降低的趋势，但无显著性差异(P＞0.05)。 二：大黄素对P38MAPK蛋白的影响免疫组化显示：P-P38MAPK主要表达在肾小球系膜细胞及肾小管细胞胞浆内，偶有胞核表达，模型组磷酸化P38MAPK阳性表达相对百分含量明显高于正常组、大黄素组(P均＜0.05)。 westernblot检测表明，模型组磷酸化P38MAPK蛋白表达为正常对照组的1.98倍(P＜0.05)，为大黄素组的1.82倍(P＜0.05)；正常组和大黄素组表达无显著性差异(p＞0.05)；模型组T-P38MAPK表达高于正常组和大黄素组，但三组之间无统计学意义(p＞0.05)；P-P38MAPK与T-P38MAPK的比值，正常组、模型组和大黄素组分别为：0.937、1.393、0.947。 三：大黄素对磷酸化CREB的影响免疫组化显示：磷酸化CREB主要表达在肾小球系膜细胞，脏层上皮细胞、内皮细胞胞核内，小管也有部分表达；模型组磷酸化CREB阳性表达相对百分含量明显高于正常组、大黄素组(P＜0.05)。westernblot检测发现，实验第12周时，模型组P-CREB灰度均值为正常组的1.94倍(P＜0.05)，大黄素的1.63倍(P＜0.05)，正常组和大黄素组灰度值无显著性差异(p＞0.05)，三组P-CREB的变化趋势与P-P38MAPK变化趋势相同。 四：大黄素对FN的影响westernblot结果表明，实验第12周时，模型组FN的表达明显增多，分别为正常对照组的1.96倍(P＜0.05)、大黄素组的1.60倍(P＜0.05)；正常组和大黄素组灰度值无显著性差异(p＞0.05)。 结论 链脲佐菌素诱导的糖尿病肾损伤大鼠模型肾功能明显受损，肾组织P-P38MAPK，P-CREB及其FN的表达显著升高。大黄素具有较好的改善糖尿病肾损伤大鼠肾功能的作用，其作用与抑制P38MAPK及其CREB的表达进而下调FN的表达有关。 创新点：初步阐明无明显降糖作用的大黄素对糖尿病肾损伤大鼠肾功能的保护作用与其抑制高糖激活的p38MAPK信号转导通路有关。