目的:骨关节炎（OA）是一种退行性关节疾病,其临床特征包括关节软骨丢失、滑膜炎、软骨下骨硬化和骨赘形成。OA的加重给患者带来身体疼痛和不便,严重降低了他们的生活质量。因此,预防和减缓OA的发生和发展是当今社会最紧迫的健康问题之一。OA的病因是复杂且多因素的。从宏观角度来看,衰老、劳损、外伤等因素会影响滑膜和软骨;从微观角度来看,关节细胞代谢平衡的破坏导致促炎性分子的过度表达和软骨基质微环境的变化。因此,深入了解参与炎症介质释放和软骨降解的细胞及分子机制对OA治疗具有重要意义。作为膝关节最重要的结构部分,软骨直接影响OA的发生和发展。II型胶原蛋白与其他胶原蛋白和非胶原蛋白结合形成稳定的网状结构,为软骨提供拉伸强度。作为软骨中唯一的细胞类型,软骨细胞合成并包裹在细胞外基质中。细胞环境中的化学和机械变化严格控制着软骨的结构和生化成分。因此,OA与软骨细胞状态和细胞外基质的分解代谢有关。转录因子核因子-（NF-）κB在炎症中起关键作用。NF-κB通路的激活会抑制软骨细胞合成代谢并诱导基质降解蛋白酶的表达,例如基质金属蛋白酶（MMP）和具有血小板反应蛋白基序的去整合素和金属蛋白酶（ADAMTS）。此外,NF-κB活化介导OA软骨细胞产生分解代谢细胞因子和趋化因子,包括肿瘤坏死因子-（TNF-）α、白细胞介素-（IL-）1β和受体激活剂NF-κB配体（RANKL）。这些分子通过正反馈回路减少胶原蛋白合成并增强NF-κB信号传导。由P2RX7基因编码的嘌呤能受体P2X7受体（P2X7R）与炎症高度相关。P2X7R亚基的功能性离子通道由质膜中的稳定三聚体组成。与三磷酸腺苷（ATP）结合后,P2X7门控离子通道打开以介导Na+和Ca2+内流和K+外流,导致快速去极化。P2X7也可以被Bz ATP激活,Bz ATP是一种比ATP效力更强的ATP类似物。P2X7依赖性信号通路涉及细胞因子释放,例如:K+外流是激活NLRP3炎症小体的重要前提,蛋白酶（如半胱天冬酶、组织蛋白酶和MMP）和转录因子（如NF-κB p65、HIF-1α和PI3K-AKT-GSK-3β）。总体而言,P2X7调节一系列与炎症有关的信号通路,包括离子流、蛋白酶激活、膜反应和分泌。明晰P2X7的功能可以深入了解OA的发生和发展。作为炎症的关键开关,P2X7主要介导下游反应以激活炎性小体,炎性小体是细胞焦亡的核心组分,包括受体蛋白NLRP3、衔接蛋白ASC和pro-caspase-1。NLRP3激活并裂解caspase-1以引起生物活性IL-1β的分泌,从而导致炎症反应。NLRP3激活以两种方式发生。首先,NF-κB信号通路增加pro-IL-1β和NLRP3的合成。其次,开始寡聚化以组装NLRP3炎性小体。P2X7通道或膜孔的开放会改变细胞中的局部离子微环境,从而驱动炎性小体成分的募集和组装。然而,P2X7是否可以诱导软骨细胞的焦亡性炎症以加重OA尚不清楚。我们提出假说,软骨细胞中激活的P2X7R通过NF-κB/NLRP3通路交互促进细胞外基质降解和IL-1β释放,从而加剧OA的发生和发展。该研究的目的是探讨P2X7在软骨细胞的OA样焦亡性炎症中的功能和机制。膝关节腔内碘乙酸（MIA）注射通常用于创建OA大鼠模型;然而,其在软骨细胞中诱导OA样表型的能力尚不清楚。据我们所知,这项研究是较早发掘MIA刺激是否会改变软骨细胞表型的研究,特别是在细胞外ATP和P2X7表达水平方面。我们还检查了P2X7R拮抗剂、激动剂和通路抑制剂对P2X7表达和激活的影响,以探索OA的潜在因果机制。总的来说,我们的发现可能为OA的治疗策略提供一个新的视角。研究方法:1.提取正常适龄的SD大鼠的原代软骨细胞,经过培养、传代后,施加不同作用浓度和作用时间的MIA进行干预,分别设置浓度梯度为0、0.75、1.5、3μM和时间梯度为12、24 h。通过CCK-8细胞活力检测实验,观察原代软骨细胞在不同作用浓度和作用时间的MIA的干预下,细胞活力的变化情况。从而找到合适的作用浓度和作用时间的MIA用于后续细胞实验。2.在初步确定合适的MIA作用时间后,为进一步判断不同浓度的MIA对诱导软骨细胞产生焦亡性炎症表型的影响,我们使用LDH释放和ATP浓度检测技术,检测了细胞上清中的LDH水平和ATP水平。通过流式细胞学技术检测active caspase-1/PI双染阳性细胞的占比。此外,为判断软骨细胞处于不同程度的炎症环境下,P2X7、MMP13、collagen II和cleaved IL-1β的表达水平是否有差异,我们通过WB免疫蛋白印迹和q RT-PCR技术检测相应指标的m RNA和蛋白水平的变化。3.在确定合适的MIA作用时间及作用浓度后,为判断不同表达激活水平下的P2X7是否与软骨细胞的胞外基质降解及焦亡性表型有关,我们使用了P2X7的选择性抑制剂A740003和选择性激动剂Bz ATP。在CCK-8细胞活力检测实验中,对于A740003组别,设置浓度梯度为0、10、20、50μM和时间梯度为12、24 h;对于Bz ATP组别,设置浓度梯度为0、20、50、100μM和时间梯度为12、24 h。从而找到合适的作用浓度和作用时间的P2X7抑制剂和激动剂用于后续实验。4.在初步确定合适的A740003和Bz ATP作用时间后,我们在MIA诱导的炎症环境下使用不同浓度的A740003和Bz ATP,判断抑制剂和激动剂是否能调节P2X7的表达激活水平。并通过WB免疫蛋白印迹和q RT-PCR技术检测信号通路及细胞表型的相应指标的m RNA和蛋白水平的变化,判断不同表达激活水平的P2X7是否会对下游通路和指标产生影响。5.在确定合适的A740003和Bz ATP作用时间及作用浓度后,为判断NF-κB和NLRP3信号通路是否在P2X7诱导的细胞表型改变中发挥关键作用,我们使用了NF-κB抑制剂Bay 11-7082和NLRP3抑制剂CY-09。通过CCK-8细胞活力检测实验,判断Bay 11-7082和CY-09对恢复软骨细胞活力的影响。通过检测细胞上清中IL-1β和LDH水平及流式细胞学技术,判断抑制NF-κB和NLRP3信号通路对缓解软骨细胞焦亡性表型的影响。6.通过细胞免疫荧光技术,判断Bay 11-7082和CY-09对collagen II的表达水平、NF-κB p65的入核情况和caspase-1/PI的共定位情况的影响。通过TEM细胞透射电镜技术,判断软骨细胞形态的改变如细胞肿胀、细胞膜破损和细胞核皱缩等。7.设置回复实验,通过ROS水平检测技术判断抑制NF-κB和NLRP3信号通路对减少软骨细胞氧化应激水平的影响。通过WB免疫蛋白印迹和q RT-PCR技术检测胞外基质降解及焦亡性表型的相应指标的m RNA和蛋白水平的变化,判断NF-κB和NLRP3被抑制后,是否能有效抵消P2X7表达激活带来的影响。8.在动物实验中,将SD大鼠随机分为五组。使用适当剂量的MIA给适龄的SD大鼠创建OA模型,共四组。除OA组外,其余三组分别向膝关节腔内注射适当剂量的A740003、Bz ATP及Bay 11-7082和CY-09。通过micro-CT技术的三维扫描分析图和对相应指标的数据分析,判断大鼠膝关节的骨破损和骨溶解情况。通过检测膝关节腔灌洗液中的IL-1β水平,判断在P2X7抑制剂、激动剂以及NF-κB和NLRP3信号通路抑制剂对于缓解大鼠OA发生发展的作用。9.动物模型造模完成后,取材获得组织切片。通过HE和TB染色进行OARSI评分,判断大鼠膝关节的软骨降解和OA情况。通过TUNEL染色判断不同组别的切片中软骨细胞的死亡占比情况。通过IHC免疫组织化学染色,检测P2X7、MMP13、collagen II、NF-κB p65、NLRP3、caspase-1和IL-1β的表达水平变化。结果:1.造模剂MIA诱导了软骨细胞产生炎症表型并增加了P2X7的表达水平（1）CCK-8细胞活力检测:当MIA作用浓度为1.5μM,作用时间为12 h时,软骨细胞的活力水平出现显著下降。当MIA作用浓度进一步增大或作用时间进一步延长时,此效应更加明显。比如,MIA作用浓度为3μM,作用时间为24h时,软骨细胞的活力水平甚至只有对照组的一半。（2）LDH释放检测:当MIA作用时间为12 h时,随着MIA浓度增加,软骨细胞培养上清中的LDH释放水平也随之升高。当MIA作用浓度为1.5μM,LDH释放水平出现显著升高。（3）细胞流式学技术检测:当MIA作用时间为12 h时,随着MIA浓度增加,软骨细胞中active caspase-1/PI双染阳性细胞的占比也随之升高。当MIA作用浓度为1.5μM,双染阳性细胞的占比出现显著升高。（4）ATP水平检测:当MIA作用时间为12 h时,随着MIA浓度增加,软骨细胞培养上清中的ATP水平也随之升高。当MIA作用浓度为1.5μM,ATP水平出现显著升高。（5）WB免疫蛋白印迹:当MIA作用时间为12 h时,随着MIA浓度增加,P2X7、MMP13、cleaved IL-1β的表达水平也随之升高,而collagen II的表达水平随之下降。当MIA作用浓度为1.5μM,以上指标的表达水平变化均出现显著差异。（6）q RT-PCR:当MIA作用时间为12 h时,随着MIA浓度增加,P2X7、MMP13、cleaved IL-1β的m RNA水平也随之升高,而collagen II的m RNA水平随之下降。当MIA作用浓度为1.5μM,以上指标的表达水平变化均出现显著差异。2.抑制剂A740003和激动剂Bz ATP调节P2X7的表达激活水平,进而影响胞外基质降解和IL-1β释放（1）CCK-8细胞活力检测:P2X7抑制剂A740003的作用浓度与作用时间的变化并不影响软骨细胞的活力水平。P2X7激动剂Bz ATP在作用浓度为50μM、作用时间为12 h时,软骨细胞的活力水平出现明显下降。并且随着Bz ATP作用浓度的增大或者作用时间的延长,细胞活力水平呈进一步下降。当Bz ATP作用浓度为100μM、作用时间为24 h时,细胞活力水平甚至只有对照组的一半。（2）WB免疫蛋白印迹:随着A740003浓度的增大,MIA诱导的P2X7以及信号通路和表型等指标的表达水平变化得到逐步逆转。当A740003作用浓度为20μM时,以上指标的表达水平与MIA 1.5μM组别相比具有显著性差异。对于Bz ATP,其浓度增大,进一步放大了MIA诱导的指标变化趋势。当Bz ATP作用浓度为50μM时,以上指标的表达水平与MIA 1.5μM组别相比具有显著性差异。（3）q RT-PCR:随着A740003浓度的增大,MIA诱导的P2X7以及信号通路和表型等指标的m RNA水平变化得到逐步逆转。当A740003作用浓度为20μM时,以上指标的m RNA水平与MIA 1.5μM组别相比具有显著性差异。对于Bz ATP,其浓度增大,进一步放大了MIA诱导的指标变化趋势。当Bz ATP作用浓度为50μM时,以上指标的m RNA水平与MIA 1.5μM组别相比具有显著性差异。3.NF-κB或NLRP3通路抑制剂有效缓解了软骨细胞的焦亡性炎症（1）CCK-8细胞活力检测:与对照组相比,MIA 1.5μM组别的细胞活力水平显著下降。不过这一趋势在A740003 20μM的作用下得到有效逆转,在Bz ATP50μM的作用下却被进一步发放大。在施加NF-κB抑制剂Bay 11-7082或NLRP3抑制剂CY-09后,均有效升高了细胞活力水平。（2）细胞流式学技术检测:A740003有效减少了MIA诱导的active caspase-1/PI双染阳性细胞的占比,Bz ATP则进一步增加了软骨细胞的死亡数量。而Bay11-7082或CY-09有效逆转了MIA和Bz ATP造成的现象,促进了细胞的存活。（3）ELISA检测IL-1β水平:A740003有效减少了MIA诱导的IL-1β的释放,Bz ATP则进一步增加了细胞培养上清中的IL-1β水平。而Bay 11-7082或CY-09有效逆转了MIA和Bz ATP造成的现象,缓解了细胞炎症。（4）LDH释放检测:A740003有效减少了MIA诱导的LDH的释放,Bz ATP则进一步增加了细胞培养上清中的LDH水平。而Bay 11-7082或CY-09有效逆转了MIA和Bz ATP造成的现象,降低了细胞死亡程度。（5）细胞免疫荧光:A740003有效上调了collagen II的表达水平,减少了NF-κB p65的入核和caspase-1/PI的共定位。Bz ATP造成的影响与A740003相反,而Bay 11-7082或CY-09造成的影响与A740003相同。4.抑制NF-κB和NLRP3改变了细胞形态,减少了ROS的产生和炎性因子的释放（1）TEM细胞透射电镜:在MIA和Bz ATP的影响下,软骨细胞出现细胞肿胀、细胞膜破损和细胞核皱缩等现象。而A740003、Bay 11-7082和CY-09有效缓解了以上现象,维持了细胞形态的稳定。（2）ROS产生检测:回复实验中,Bz ATP进一步增加了MIA诱导的ROS的产生,而这一效应在Bay 11-7082或CY-09的作用下得到有效缓解。（3）WB免疫蛋白印迹:Bz ATP进一步上调了MIA诱导的MMP13、cleaved IL-1β、cleaved caspase-1的蛋白表达水平,进一步下调了collagen II的蛋白表达水平。在抑制NF-κB和NLRP3后,以上指标的蛋白表达水平变化得到显著逆转。（4）q RT-PCR:Bz ATP进一步上调了MIA诱导的MMP13、cleaved IL-1β、cleaved caspase-1的m RNA水平,进一步下调了collagen II的m RNA水平。在抑制NF-κB和NLRP3后,以上指标的m RNA水平变化得到显著逆转。5.P2X7的表达激活增加了大鼠膝关节的骨丢失和骨溶解（1）micro-CT三维扫描和骨形态数据分析检测:膝关节腔内注射了MIA或Bz ATP后,胫骨的软骨下骨的骨溶解加剧。而A740003、Bay 11-7082和CY-09有效减少了骨丢失,维持了膝关节的完整性。BV、BV/TV、Tb.Sp、Tb.N和Tb.Th的参数变化证实了P2X7抑制剂和通路抑制剂的保护作用。（2）ELISA检测IL-1β水平:MIA诱导的大鼠OA模型中,膝关节腔灌洗液中的IL-1β水平显著上升。注射Bz ATP后,IL-1β水平进一步上升。而在注射A740003、Bay 11-7082和CY-09后,IL-1β水平出现显著下降。6.动物实验中,P2X7的表达激活加剧了OA的发生发展（1）HE和TB染色:P2X7的表达激活加剧了软骨的丢失和破坏,抑制P2X7或者抑制P2X7的下游通路有效缓解了OA的发生发展,以上在OARSI评分结果中得到体现。（2）TUNEL染色:死亡的软骨细胞呈橙红色荧光,阳性细胞占比在MIA和Bz ATP组别明显增大,而在A740003、Bay 11-7082和CY-09组别明显减少。（3）IHC免疫组织化学染色:P2X7、MMP13、NF-κB p65、NLRP3、caspase-1、IL-1β的表达水平在MIA和Bz ATP组别明显上升,而在A740003、Bay 11-7082和CY-09组别明显下降。Collagen II的表达水平则呈相反趋势。结论:1.适当作用浓度1.5μM和作用时间12 h的MIA可诱导软骨细胞产生OA样炎症表型。2.MIA可诱导软骨细胞释放LDH到上清和形成胞外相对高浓度的ATP环境。3.P2X7的表达激活水平与细胞炎症程度呈正相关。4.正常环境下,P2X7抑制剂A740003不影响细胞状态。P2X7激动剂Bz ATP增加P2X7的表达激活水平,导致细胞活力水平下降。5.A740003抑制P2X7,有效缓解MIA给软骨细胞带来的影响;而Bz ATP的作用则是放大MIA的影响。6.NF-κB抑制剂Bay 11-7082和NLRP3抑制剂CY-09有效缓解MIA和Bz ATP给软骨细胞带来的影响。7.NF-κB和NLRP3形成的通路交互在P2X7介导的软骨细胞表型改变中发挥关键作用。8.P2X7的表达激活加剧了大鼠膝关节OA的发生发展。9.A740003、Bay 11-7082和CY-09有效缓解大鼠膝关节的骨破坏。10.综上所述,P2X7在骨关节中介导NF-κB/NLRP3通路交互诱导焦亡性炎症和软骨降解。