[目的]肺癌是世界上发病率和死亡率最高,增长最快的恶性肿瘤之一,是全球男性和女性癌症死亡的主要原因。肺癌病理类型包括非小细胞肺癌（NSCLC）和小细胞肺癌（SCLC）,超过85%的病例为非小细胞肺癌。非小细胞肺癌具有遗传和细胞异质性。虽然在肺癌的诊断和治疗上取得了长足的进步,但是NSCLC的总体治愈率和生存率仍然很低,尤其是在转移性疾病中。肺癌发生和转移的具体分子机制目前还不完全清楚。肺癌的发生和侵袭是一个复杂而动态的过程,涉及肿瘤组织的内在遗传异常及其与免疫系统的相互作用。鉴于此,深入研究肺癌的发生、发展和转移的机制,对开发有效的治疗措施、提高肺癌的生存率具有重要的临床价值和社会效益。近年来发现,CMTM6 基因（chemokine-like MARVEL transmembrane domain containing family member 6）与肿瘤免疫逃逸有关。此基因又名趋化素样因子超家族6。该基因位于3号染色体短臂2区2带3亚带,其编码的蛋白质产物具有四次跨膜蛋白超家族（TM4SF）和MARVEL结构域,因此与多种肿瘤密切相关。研究显示CMTM6和PD-L1共同定位于肿瘤细胞表面,呈正相关,CMTM6通过稳定肿瘤细胞表面PD-L1分子,从而使T细胞抑制,使肿瘤细胞逃脱T细胞杀伤。然而CMTM6和PD-L1的表达不完全呈正相关,表明CMTM6不只与PD-L1相关,可能还有其它的重要分子和CMTM6相互作用共同影响肿瘤预后。同时其它研究显示CMTM6在多种肿瘤组织中表达,与肿瘤预后不良有非常密切的关系。但在原发肺肿瘤中表达及与预后的关系尚未清楚,且CMTM6在肺癌发生发展中的功能及分子机制亦知之甚少。同时,CMTM6作为一种新的生物标志物,对其功能的研究还远远不够。为此本课题拟检测CMTM6在非小细胞肺癌中的表达情况,分析其表达与相关临床病理参数之间的关系;通过体内外实验,研究肺癌发生、发展和转移过程中的作用;探究CMTM6调节肺癌细胞增殖和侵袭的机制。[方法]1.利用免疫组织化学检测石蜡标本非小细胞肺癌组织、正常肺组织中CMTM6的表达,并分析CMTM6的表达与肿瘤分化、分期、转移和临床预后等相关临床病理参数的关系;2.建立干扰CMTM6的稳转肺癌细胞株,通过体外MTT实验,平板克隆形成实验,流式细胞检测凋亡检测肿瘤细胞的增殖能力;通过划痕实验检测肿瘤细胞的迁移能力;Transwell实验检测肿瘤细胞的侵袭能力。3.体内实验:用干扰CMTM6的稳转肺癌细胞株建立裸鼠皮下肺癌移植瘤模型,检测CMTM6在裸鼠体内对肺癌细胞增殖的影响;检测裸鼠心、肝、脾、肺、肾、大脑、大肠、小肠有无肿瘤侵袭。4.利用转录组测序筛选CMTM6差异表达基因,通过对敲低CMTM6的肺癌细胞和对照组肺癌细胞mRNA基因表达量的统计,找出差异表达基因;对差异基因进行GO功能富集和KEGG信号通路富集;构建蛋白质互作网络并用cytoscape软件进行了可视化,提取和CMTM6相互作用的核心基因;构建了差异基因-信号通路网络,提取主要作用信号通路的相关蛋白。5.差异表达基因验证:通过流式细胞术检测干扰CMTM6肺癌细胞周期分布;通过western blot检测干扰CMTM6后细胞周期相关蛋白P53,P21,P27,Cyclin A,Cyclin D,Cyclin E,CDK2,CDK4 和 ERK,pERK,AKT,pAKT 的表达情况。[结 果]一、CMTM6在肺癌组织中的表达1.免疫组化结果显示CMTM6阳性表达主要定位于细胞膜和细胞质,呈棕褐色或棕黄色。2.肺癌组织CMTM6蛋白表达水平（161.04±86.60）高于邻近正常肺组织（71.20±45.10）（P<0.05）。3.CMTM6表达与肿瘤T分期、肿瘤组织学类型和肿瘤浸润淋巴细胞相关（P<0.05）,与患者年龄、性别、肿瘤分化程度、淋巴结浸润无关。4.Kaplan-Meier生存分析结果显示,CMTM6高表达患者的5年总体生存期明显短于低表达患者（P<0.01）。二、CMTM6促进肺癌细胞增殖和迁移、侵袭能力1.体外实验:MTT结果显示,CMTM6干扰的稳转肺癌株生长速度显著慢于对照组（P<0.01）。平板克隆形成实验显示,CMTM6干扰的稳转肺癌株克隆形成的数量显著少于对照组（P<0.05）。流式细胞术检测凋亡结果显示,CMTM6干扰稳转肺癌株凋亡率高于对照组（P<0.05）。划痕实验结果显示,CMTM6干扰的稳转肺癌株细胞迁移的速度明显减慢（P<0.05）。Transwell实验结果显示,CMTM6干扰稳转肺癌株侵袭细胞的数量明显少于对照组（P<0.05）。2.体内实验:裸鼠皮下成瘤实验表明,与对照组相比,CMTM6干扰的稳转肺癌株肿瘤生长速度较慢,肿瘤体积较小（P<0.05）。免疫组化结果显示,CMTM6干扰组的Ki-67阳性率（39.6%）显著低于对照组（76.4%）（P<0.05）。裸鼠心、肝、脾、肺、肾、大脑、大肠、小肠HE检测未见转移瘤。三、CMTM6调节肺癌细胞增殖和侵袭的机制1.转录组测序得到CMTM6差异表达基因4993个,上调基因2466个,下调基因2527个。2.对这些基因进行GO功能富集和KEGG信号通路富集,发现CMTM6差异表达基因在生物学过程主要富集在有丝分裂细胞周期相变,DNA复制和染色体分离。细胞组成主要富集在染色体,着丝粒区,染色体区和着丝粒。分子功能主要集中在作用于DNA的催化活性,核孔结构组成和微管蛋白结合。3.KEGG信号通路主要富集在DNA复制,细胞周期和碱基切除修复。4.蛋白质互作网络提取与CMTM6相互作用的核心基因10个,分别为UBC,TP53,PRDM10,HSP90AA1,TSPO,UBB,CDK1,TOP2A,CAD,CDK2。5.差异基因-信号通路网络得到主要作用信号通路的相关蛋白。作用P53信号通路的主要由TP53,CDK1,CDK2,CCND1,CCND3等。作用于细胞周期信号通路的主要有TP53,CDK1,CDK2,CDK6,CCNB1等。作用于DNA复制信号通路的主要有MCM2,MCM5,MCM7,POLE2,LIG1等。6.CMTM6差异表达的基因主要富集在细胞周期。7.流式细胞仪检测细胞周期结果显示,干扰CMTM6则使细胞周期阻滞于G0/G1期,细胞不能进入G2/M期,抑制细胞增殖。8.western blot 检测细胞周期相关蛋白 P53,P21,P27,CyclinA,CyclinD,Cyclin E,CDK2,CDK4的表达,干扰CMTM6可以通过激活P53,进一步诱导P27基因的表达,从而抑制Cyclin A的活性,将细胞周期阻滞在G0/G1期。9.western blot 检测 ERK,pERK,AKT,pAKT 蛋白表达,结果显示 CMTM6干扰稳转肺癌株下调了 pERK的表达,抑制ERK的磷酸化,但对AKT没有影响。[结 论]1.非小细胞肺癌组织中CMTM6表达水平显著上调,CMTM6表达与肿瘤T分期、肿瘤组织学类型和肿瘤浸润淋巴细胞相关。2.CMTM6表达与肺癌预后呈负相关。3.干扰CMTM6抑制肺癌细胞的增殖、侵袭迁移能力。4.CMTM6促进肺癌细胞的增殖、侵袭迁移能力,其调控机制可能与P53介导细胞周期阻滞有关。CMTM6通过MAPK/ERK信号通路介导肺癌细胞的增殖和迁移。5.CMTM6可作为评估NSCLC预后的独立危险因素,为临床制定个体化NSCLC治疗方案提供依据。