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RNA沉默(RNA silencing)是一种依赖核酸序列特异性的抗病毒防御机制。针对寄主的这一防御机制,许多病毒进化出相应的RNA沉默抑制子。自1998年首次发现植物病毒编码的基因沉默抑制因子以来,已在多种动、植物病毒中发现该类蛋白,并对其中部分蛋白的作用方式进行了研究。目前,沉默抑制子的鉴定和作用机理分析已成为病毒学领域的一个研究热点。本研究以禽流感病毒的几种致病蛋白基因为候选沉默抑制子,利用农杆菌介导的瞬时表达系统,对这些候选沉默抑制子进行鉴定,就沉默抑制子的作用机理进行了初步探讨,具体结果如下:1.克隆新城疫病毒致病基因F、禽流感病毒致病基因NS1和火鸡疱疹病毒HVT基因,分别构建其植物双元表达载体(pBI121)35S-F、35S-HVT和35S-NS1,成功转化农杆菌GV3101。2.以pBIN61-P19质粒、提取的转GFP本生烟(16c)的总DNA和提纯的马铃薯X病毒RNA为模板,经PCR或RT-PCR扩增,分别得到P19、GFP和P25的全长片段,分别构建其植物双元表达载体35S-P19、35S-GFP和35S-P25,成功转化农杆菌GV3101。3.以35S-GFP+35S-空载体为阴性对照, 35S-GFP+35S-P19和35S-GFP+35S-P25为阳性对照,对侯选沉默抑制子进行农杆菌介导的瞬时表达分析。分别将携带候选蛋白基因F、HVT、NS1的农杆菌与携带35S-GFP的农杆菌共侵染,侵染区表型分析表明F对GFP表达没有影响,而HVT能诱发GFP的快速沉默,NS1则能增强GFP的表达。这说明NS1具有沉默抑制子功能。4. NS1对系统性沉默的表型观察中发现,其不能阻断系统性沉默信号。在9 dpi左右,侵染区仍保持绿色,直至叶片脱落,而新生叶片叶脉开始变红,出现不同程度的系统性沉默症状。在32dpi左右,整个植株系统性沉默。结果表明NS1能够有效的抑制局部性沉默,而不能阻断沉默信号的系统性传播。5.构建GFP原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中诱导表达。以诱导蛋白免疫小白鼠,制备抗血清,测得效价为1:1500,可以用于烟草中GFP蛋白的免疫分析。6.分别提取35S-空载体、35S-P19、35S-NS1与35S-GFP农杆菌共侵染区在3dpi和7dpi的总蛋白,Western blot检测侵染区GFP的含量。在3dpi,空载体侵染区GFP有一定量的表达,但在7dpi基本检测不到GFP,分析为在3dpi GFP有一定量的瞬时表达,在7dpi发生了GFP的基因沉默。P19和NS1在3dpi和7dpi的侵染区均能检测到高表达的GFP ,这与侵染区绿色荧光表型一致,分析为NS1像P19一样作为沉默抑制子能增强外源GFP的表达量。7.分别提取35S-空载体、35S-P19、35-NS1与35S-GFP农杆菌共侵染区在3dpi和7dpi的总RNA,Northern blot检测侵染区GFP mRNA的含量。在3dpi,空载体侵染区GFP mRNA含量明显低于P19和NS1的侵染区,而7 dpi侵染区GFP mRNA的含量均比3dpi的低,其中NS1的侵染区GFP mRNA含量仍然保持相对较高的水平,进一步表明NS1是一种RNA沉默抑制子。