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【研究目的】血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)是一种独特的没有内皮细胞参与而由仅肿瘤细胞形成的血管生成模式。VM参与肿瘤的侵袭,转移,与肿瘤患者的不良预后相关。Runx2是Runx转录因子家族的成员之一。研究发现Runx2在肿瘤细胞中的过表达会增强肿瘤细胞的转移侵袭能力。本研究通过研究Runx2对肝癌VM的影响,希望为肝癌的临床治疗提供新的治疗靶点。【研究方法】1、收集天津总医院和天津市肿瘤医院自2005年至2015年间经手术切除,未接受放化疗,并且有完整随访资料病例89例。使用免疫组织化学染色方法,分析了Runx2与VM、E-cadherin、Vimentin、VE-cadherin、Galectin-3、患者年龄,患者性别,肿瘤的大小,病理分级(Ⅰ/Ⅱ,Ⅲ/Ⅳ),临床分期(Ⅰ/Ⅱ,Ⅲ/Ⅳ),是否转移之间的关系。使用卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)生存分析比较Runx2对预后的影响。2、根据Bel7402、SMMC7721、HepG2、97L、97H细胞系的Runx2表达水平,选取Runx2表达水平最低的HepG2细胞,Runx2表达水平最高的SMMC7721细胞。HepG2细胞转染Runx2过表达质粒,在SMMC7721细胞中转染Runx2干扰质粒。HepG2-Runx2细胞中转染LGALS3干扰质粒,SMMC7721-shRunx2细胞中转染LGALS3过表达质粒。通过western blot和RT-PCR验证了转染结果。3、使用Western blot和RT-PCR来研究转染后细胞中Galectin-3,EMT相关的分子如Vimentin、E-cadherin,VM相关标志物VE-cadherin的表达情况。4、使用划痕和侵袭实验研究转染后细胞及对照组的迁移侵袭能力5、使用三维培养实验研究转染后细胞形成VM样管状结构的能力。6、使用免疫荧光共聚焦实验研究细胞形成VM样管状结构VE-cadherin的表达情况。【研究结果】1、免疫组化染色结果显示,Runx2阳性表达有55例,Runx2阴性表达34例。Runx2的表达与VM(χ2=10.337,p=0.002),E-cadherin(χ2=5.848,p=0.027),Vimentin(χ2=10.837,p=0.002),VE-cadherin(χ2=14.008,p=0.001)和Galectin-3(χ2=5.92,p=0.018)的表达相关。在53例切片中发现VM(59.6%)。在89例肝癌标本中,55例Runx2阳性病例中发现40例VM(72.7%),而34例Runx2阴性病例中,VM出现例数为13(38.2%)。Vimentin、VE-cadherin和Galectin-3在Runx2阳性病例中的表达率高于在Runx2阴性病例中的表达率。而E-cadherin的在Runx2阳性病例中的表达率低于在Runx2阴性病例中的表达率。临床病理资料分析结果显示:Runx2与患者的病理分级(χ2=6.994,p=0.008)和转移(χ2=8.106,p=0.004)有关。Runx2在低分化(Ⅲ/Ⅳ)的患者中表达高于高分化(Ⅰ/Ⅱ)的患者。Runx2在有转移的肝癌患者中表达高于无转移的肝癌患者。Runx2的表达与患者的年龄,性别,是否有乙肝,是否有肝硬化,肿瘤大小无关。生存分析结果表明,Runx2阳性患者生存时间短于Runx2阴性患者。2、Western blot和RT-PCR实验证实:HepG2细胞在转染了Runx2过表达质粒后Runx2表达水平上升,SMMC7721细胞在转染了Runx2降表达质粒后Runx2表达水平下降。3、Western blot和RT-PCR实验结果显示,E-cadherin和Vimentin是EMT相关蛋白,上调HepG2细胞Runx2水平后,较对照组,E-cadherin表达下降,Vimentin表达上升;Galectin-3和VE-cadherin的表达水平上升。下调Runx2水平后,SMMC7721细胞,EMT相关蛋白E-cadherin表达水平上升,Vimentin表达水平下降;Galectin-3和VE-cadherin的表达水平下降。4、伤口愈合实验和Matrigel侵实验结果显示,HepG2细胞Runx2的表达上升后,细胞迁移能力和侵袭能力增强;下调Runx2后,SMMC7721细胞迁移能力和侵袭能力降低。5、Matrigel三维培养实验结果表明,HepG2细胞Runx2的表达上升后,细胞可以形成类似VM结构。SMMC7721细胞Runx2的表达下降后,形成的类似VM结构数量下降。6、Western blot和RT-PCR结果显示,HepG2-Runx2细胞在转染LGALS3干扰质粒后Galectin-3的表达水平下降。SMMC7721-shRunx2细胞在转染LGALS3过表达质粒后Galectin-3的表达水平上升。Runx2的表达水平在上调和下调Galectin-3后未出现明显变化。7、Western blot和RT-PCR结果显示,下调Galectin-3的HepG2-Runx2,EMT相关蛋白E-cadherin表达上升,Vimentin表达下降。上调Galectin-3的SMMC7721-shRunx2细胞,EMT相关蛋白E-cadherin表达下降,Vimentin表达下降。8、划痕和侵袭实验结果显示,下调Galectin-3后,HepG2-Runx2细胞迁移侵袭能力减弱;SMMC7721-shRunx2细胞迁移的能力在上调Galectin-3后增强。9、Matrigel三维培养结果显示,下调Galectin-3后,HepG2-Runx2细胞无法形成类似VM的管状结构。上调Galectin-3后,SMMC7721-shRunx2细胞形成的类似VM的管状结构数量较对照组上升。10、对HepG2-Runx2,SMMC7721和SMMC7721-shRunx2-LGALS3细胞形成的类似VM的管状结构进行VE-cadherin免疫荧光染色显示,细胞形成的管状结构管壁表达高VE-cadherin。【研究结论】1、Runx2的表达与肝癌患者的病理分级、是否有转移、分组有关;与年龄、性别、是否有乙肝、是否有肝硬化和肿瘤大小无关。同时,Runx2的表达与E-cadherin、Vimentin、VE-cadherin、Galectin-3和VM相关。2、Runx2可以增强肝癌细胞的迁移侵袭以及形成VM的能力。Runx2可能通过Galectin-3通路促进肝癌细胞发生EMT来促进VM的形成。