论文部分内容阅读
目的与意义花生四烯酸(arachidonic acid, AA)是生物体内最丰富的物质之一,是体内多种重要活性物质的来源,主要是以酯化的形式结合在细胞膜内侧的脂肪酸上,在脂解激素刺激时由磷脂酶A2水解释放至细胞浆内。对AA的研究已有多年,最为人们熟知的是环氧化酶和脂质氧化酶代谢途径,近年研究发现AA还可通过细胞色素P450途径代谢(即AA代谢的第三条途径),包括花生四烯酸细胞色素P450表氧化酶(AA cytochrome P450 epoxygenase, CYP)途径和ω-羟化酶途径,其中AA经表氧化酶代谢产生四种EETs (5,6-, 8,9-, 11,12-和14,15-EET)。已经发现在哺乳动物有14个家族和26个亚族,而在人类仅发现有CYP2C和CYP2J表达。CYP在体内广泛分布,尤其在肝脏中表达最丰富,主要存在于内质网和线粒体,在血管中亦存在表达;目前已发现并克隆2J家族的9个基因,其中在人类仅发现了2J2,其在心脏和血管内皮细胞表达最丰富,我们和国外学者已经发现EETs在调节心血管系统稳态中发挥着重要作用,EETs可以通过激活钙离子敏感的钾通道,使平滑肌细胞处于超极化状态而扩张血管调节血压,还参与调节炎症、细胞迁移、细胞凋亡、血小板聚集和保护内皮细胞。我们的研究首次证实表氧化酶基因在不同的人类肿瘤组织中以及肿瘤细胞系中选择性高表达。研究发现转染CYP2J2和外源性EETs通过激活MAPK、PI3K/AKt、及EGFR途径促进肿瘤的恶性增殖;通过上调抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL、下调凋亡蛋白Bax来保护肿瘤细胞凋亡。这些结果表明CYP2J2在人类肿瘤的发生和发展中发挥重要的作用。然而CYP和EETs在人类肿瘤转移中的作用及其机制如何,花生四烯酸表氧化酶抑制剂在肿瘤的防治中有何意义呢?本研究通过对雌激素受体阴性、高转移的乳腺癌细胞(MDA-MB-435s)给予重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)介导的表氧化酶基因转染,探讨其对肿瘤转移的影响以及相关机制;试验了花生四烯酸表氧化酶抑制剂(17-ODYA)对裸鼠移植瘤的抑瘤效应。方法与结果1.培养MDA-MB-435s细胞,通过重组腺相关病毒介导的正义和反义CYP2J2转染,主要进行以下研究1.1 CYP2J2对MDA-MB-435s细胞增殖的影响:肿瘤是由于致瘤因素的作用,局部组织的细胞失去了对其正常生长的调控,导致异常克隆性增生。正常细胞生长依赖锚泊,有密度依赖抑制或接触抑制,肿瘤细胞则缺乏这种生长限制,甚至可在半固体琼脂中呈悬浮生长,不需要依附固定表面,不受密度限制,可持续分裂堆积生长。琼软脂克隆形成又叫锚泊不依赖生长,通过计数2-4周后软琼脂上的克隆数目来检测细胞的增殖能力,细胞在这种半固态媒体上生长是表型改变的指标之一,也是证明促有丝分裂能力的方法之一。因此我们利用软琼脂克隆形成试验来观察CYP2J2转染后在软琼脂上形成克隆的能力。结果反义2J2转染明显抑制MDA-MB-435s在软琼脂上形成克隆的能力,与GFP组(10.75±2.753)和空白对照组(11.75±2.217)比较,反义2J2转染组(3.25±2.217)形成的克隆数目少,直径小;CYP2J2(19±3.7416)转染则显著促进MDA-MB-435s细胞在软琼脂上形成克隆,且克隆较对照组和转染GFP组明显增大,而且数目多。1.2 CYP2J2对MDA-MB-435s细胞黏附于细胞外基质的影响:肿瘤的浸润过程首先是肿瘤细胞黏附并降解细胞外基质,然后迁移穿过细胞外基质。我们选取细胞外基质主要成分之一纤维粘连蛋白(fibronectin, FN)来研究表氧化酶及其产物对肿瘤细胞黏附的影响。结果表明,与对照组比较,转染反义CYP2J2显著抑制MDA-MB-435s细胞黏附于基质成分黏附细胞数约是对照组的50%,而转染CYP2J2使其过表达表氧化酶则显著促进MDA-MB-435s细胞黏附(P<0.05)。用表氧化酶代谢花生四烯酸产物EETs预处理MDA-MB-435s半小时也显著的促进MDA-MB-435s细胞黏附,而表氧化酶抑制剂能显著抑制MDA-MB-435s细胞的黏附(P<0.01)。1.3 CYP2J2对MDA-MB-435s细胞游走迁移的影响:细胞的游走迁移是肿瘤浸润转移的一个重要步骤。我们利用改良的Boyden趋化小室研究CYP2J2对MDA-MB-435s细胞游走迁移的影响。实验结果显示转染反义CYP2J2的MDA-MB-435s细胞穿过多聚碳酸酯膜的细胞数下降49%,而转染正义CYP2J2的细胞穿过多聚碳酸酯膜的细胞数几乎为对照组的两倍,外源性应用表氧化酶抑制剂(17-ODYA)明显抑制MDA-MB-435s细胞的迁移,而三种EETs显著促进MDA-MB-435s细胞迁移。1.4 CYP2J2对肿瘤转移影响的在体实验研究及其可能机制:为了观察表氧化酶基因2J2是否影响肿瘤的在体转移能力,我们用rAAV-2J2、rAAV-anti2J2和rAAV-GFP感染MDA-MB-435s细胞,3天后接种至雌性裸鼠腋窝皮下,观察肿瘤生长情况。12周后处死裸小鼠,bouin’s solution固定肺组织,观察比较肺部转移瘤结节数目。结果显示CYP2J2转染后的肿瘤细胞在体内生长迅速,肿瘤结节出现的平均时间明显提前,瘤结节体积与对照组比较体积明显增大;转染反义CYP2J2的肿瘤细胞在体生长缓慢,肿瘤结节出现时间延迟,平均瘤结节体积比对照组明显减小,其中有三只在12周末仍然没有长出可以目测的移植瘤,与对照组比较差别有显著性意义(P<0.05)。接着我们观察了肿瘤在肺部的转移情况,结果发现CYP2J2显著促进了肿瘤的肺转移,肺组织表面肉眼能见的瘤结节数目为对照组的2.8倍,反义CYP2J2组则没有观察到明显的肺转移。以上结果显示CYP2J2具有促恶性肿瘤转移的作用。在此基础上,我们研究了CYP2J2和EETs促进肿瘤转移的可能机制,用Western blot方法检测EETs干预和表氧化酶基因转染对转移相关基因表达的影响,同时还用Gelatin Zymography方法检测了CYP2J2对MMPs分泌的影响。结果发现CYP2J2促进MMP-2的分泌;反义CYP2J2则抑制MMP-2的分泌;EETs和CYP2J2明显上调CD44的表达,下调nm23和CD82/KAI的表达,反义CYP2J2或CYP抑制剂则显著下调CD44的表达,上调nm23和CD82/KAI的表达。2.花生四烯酸表氧化酶抑制剂(17-ODYA)对人舌鳞癌裸鼠移植瘤抑瘤效应的实验研究将人舌鳞癌细胞系(Tca 8113)接种至BALB/c(nu/nu)裸鼠,建立人舌鳞癌裸鼠移植瘤模型,设立阴性对照组(N.S)、阳性对照组(5-FU 30mg/kg)、低剂量抑制剂组(0.5mg/只)、高剂量抑制剂组(1mg/只)和联合用药组(0.5mg/只17-ODYA+30mg/kg5-FU),观察肿瘤的生长状态,计算抑瘤率;观察移植瘤的组织病理学及超微结构改变。结果与阴性对照组比较,花生四烯酸表氧化酶抑制剂(17-ODYA)组裸鼠皮下移植瘤体积明显缩小(P<0.01),移植瘤的生长明显受到抑制;高剂量组平均肿瘤体积与低剂量组比较,抑制作用更明显,但两者之间差异无统计学意义;17-ODYA组与阳性对照组相比,高剂量抑制剂组肿瘤平均体积减小不如阳性对照组明显,但两组之间无统计学差异;联合用药组与其他组相比肿瘤明显受到抑制(P<0.01)。瘤结节的重量比较与瘤结节体积结果一致。结论:我们的研究结果显示①CYP2J2及其代谢花生四烯酸的下游产物EETs在促进肿瘤的恶性增殖、促进肿瘤细胞与细胞外基质的黏附以及促进肿瘤细胞游走运动能力等多个环节促进恶性肿瘤转移,同时还可能与促进MMPs的分泌、上调转移相关基因CD44的表达、下调转移抑制基因CD82/KAI和nm23的表达有关。②花生四烯酸细胞色素P450表氧化酶抑制剂(17-ODYA)对人舌鳞癌裸鼠移植瘤有明显的抑瘤效应,但是其作用机制、毒副作用以及与其他临床化疗药物联合的疗效尚需进一步的研究。总之,这些发现为恶性肿瘤的基因治疗提供了新的靶点,为开发新的抗癌药物提供了理论基础。但是恶性肿瘤的发生发展是一个多因素多步骤的过程,CYP作为一个独立的影响因子其作用机制还没有完全阐明,应用于临床尚有局限性,有待于进一步的研究。