研究目的异位骨化（heterotopic ossification,HO）是指在软组织中形成骨组织,主要包括遗传性HO和获得性HO两大类。遗传性HO包括进行性骨化性肌炎（FOP）和进行性骨发育异常（POH）,这是两种非常严重的全身性的异位骨化疾病,主要由于基因突变引起,人群发病率低。而获得性HO一般发生于严重创伤、烧伤、冲击伤或重大手术之后,中枢神经系统损伤也会诱发HO。HO的临床症状包括慢性疼痛、关节挛缩、活动受限等,目前治疗方法包括放疗、非甾体抗炎药（NSAIDs）和手术治疗,但治疗效果有限且容易复发。目前认为HO的形成是三个关键因素的共同作用的结果:参与HO形成的前体细胞、启动异位成骨的分子信号、损伤诱导的炎症微环境。FGFR3是调节成骨的重要分子,同时也参与淋巴管生成的调控,而淋巴管参与损伤后炎症细胞和炎症因子的引流,因此FGFR3有可能参与调控HO的形成。本课题旨在研究FGFR3对于HO调节的作用及具体细胞和分子机制,为HO的防治提供新的策略。研究方法1.建立多种转基因小鼠品系建立FGFR3flox/flox;Col2a1-Cre ERT2小鼠、FGFR3flox/flox;Prx1-Cre ERT2小鼠、Col2a1-Cre ERT2;Rosa26td Tomato小鼠、Prx1-Cre ERT2;Rosa26td Tomato小鼠、FGFR3flox/flox;Col2a1-Cre ERT2;Rosa26td Tomato小鼠、FGFR3flox/flox;Prx1-Cre ERT2;Rosa26td Tomato小鼠、Col2a1-Cre ERT2;Rosa26m Tm G小鼠、FGFR3flox/flox;Prox1-Cre ERT2小鼠、FGFR3flox/flox;BMPR1aflox/+;Col2a1-Cre ERT2小鼠、FGFR3flox/flox;BMPR1aflox/+;Prox1-Cre ERT2小鼠、FGFR3flox/flox;BMPR1aflox/flox;Col2a1-Cre ERT2小鼠、FGFR3flox/flox;BMPR1aflox/flox;Prox1-Cre ERT2小鼠品系。2.小鼠他莫昔芬（Tamoxifen,TM）注射和获得性HO模型建立雄性小鼠按照100 mg/kg剂量腹腔注射他莫昔芬。每天注射1次,连续注射5天。之后通过跟腱切断手术诱导小鼠跟腱获得性HO形成。3.小鼠X光拍照和HO标本micro-CT扫描小鼠跟腱切断术后每2周进行X光检测（术后2、4、6、8周）,记录小鼠跟腱HO发生情况。小鼠术后4周、8周取材的HO标本用4%多聚甲醛固定之后按照标准流程X光拍照。X光图像是通过美国Faxitron公司MX-20 Cabinet X光拍照系统采集获得。小鼠跟腱切断术后4周、8周HO标本4%多聚甲醛固定24小时后,使用瑞士Scanco viva CT 40μCT系统进行扫描,设置机器扫描参数为70kv,113 m A。选择扫描区域为小鼠膝关节至足底。待机器扫描及图像整合完毕后,在操作软件上对图像进行重建。在重建HO的3D形态时选择对标本整体重建（包含胫骨腓骨）,在定量统计HO体积时只选择对异位骨进行重建（不包含胫骨腓骨）。三维重建和分析的阈值统一设置为170。4.HO切片病理染色、免疫组化及免疫荧光染色HO标本脱钙、脱水后进行冰冻切片,切片厚度为10μm。跟腱切断术后4周、8周HO冰冻切片分别进行苏木素伊红、藏红固绿病理染色。每个跟腱HO标本大约能够收集30-50张冰冻切片,每个标本取6-10张切片进行病理染色,使用奥林帕斯图像采集系统拍照,每张切片采集5-8个随机视野使用骨计量分析系统（Osteometrics）进行组织形态学计量。选取3-5张典型切片进行免疫组化染色,检测HO区域软骨、成骨标志分子表达水平,使用Image J软件对阳性细胞进行统计。每批实验每个标本选取3-5张典型切片进行免疫荧光染色标记HO区域软骨、成骨细胞,另外检测LEC标志分子从而标记淋巴管内皮细胞,检测F4/80、i NOS标记促炎巨噬细胞,检测FGFR3、BMPR1a、p Smad1/5评估相关分子表达水平。5.跟腱组织RNA提取、定量PCR检测提取小鼠损伤跟腱组织RNA,通过荧光定量PCR检测跟腱HO软骨、成骨标志分子水平评估HO进展情况,检测淋巴管内皮细胞标志分子评估LEC生成情况。6.小鼠损伤跟腱组织总蛋白提取、蛋白质免疫印迹实验（Western Blot,WB）提取小鼠损伤跟腱组织总蛋白,通过蛋白质免疫印迹实验检测跟腱HO软骨、成骨标志分子水平评估HO进展情况。7.损伤跟腱原代细胞分离培养、免疫荧光染色分离小鼠损伤跟腱后充分剪碎在I型胶原酶中消化至组织匀浆,离心获取原代细胞置于内皮细胞培养基（ECM）中培养传代。将原代细胞接种于12孔板爬片至30%-40%细胞密度时进行免疫荧光染色,检测LEC相关标志分子鉴定淋巴管内皮细胞。8.小鼠吲哚菁绿（ICG）近红外（NIR）淋巴管成像参照相关文献配制0.1 mg/ml浓度的ICG（Sigma公司）生理盐水溶液,使用胰岛素注射器将10μl ICG溶液皮内注射到距离跟骨远端约2 mm的小鼠足垫内。使用Fusion FX Edge系统（Vilber Lourmat公司）采集小鼠下肢的ICG NIR成像（820 nm红外滤光片）。记录小鼠足垫内ICG信号强度作为初始信号强度,24小时后再次对小鼠下肢ICG信号进行拍照（拍摄参数与前一天保持一致）,记录小鼠足垫内ICG信号强度作为24小时信号强度。使用Evolution-Capt v18.02软件对ICG NIR拍摄图像进行分析。ICG清除率为注射后24小时足垫ICG信号强度相对于足垫ICG初始信号强度降低的百分比。9.异位骨化患者HO标本获取患者HO标本来自大坪医院创伤外科既往发生过肘关节骨折的男性患者,经内固定治疗后诊断出现异位骨化而再次进行手术治疗。根据相关文献中的方法将患者HO标本按照其肘关节骨折内固定之后到获取HO标本的时间进行分期,成骨期HO为骨折内固定术后3-6个月获取的HO标本,成熟期HO为内固定术后12-18个月获取的HO标本。10.小鼠淋巴管内皮细胞系（mLEC）培养及FGFR3敲降mLEC细胞系生长至60%左右密度时通过小干扰RNA（si RNA,瑞博公司）对FGFR3进行敲降,依照Lipofectamine RNAi MAX转染试剂（Invitrogen公司）说明书中标准流程进行操作,转染36小时后提取mLEC蛋白。通过蛋白质免疫印迹实验检测FGFR3敲降水平及BMPR1a、p Smad1/5、Smad1/5表达的改变。11.人重组FGF9和VEGF-c跟腱局部缓释FGF9局部缓释实验中雄性小鼠行跟腱切断手术后将FGF9（0、0.01、0.1、1μg）与Matrigel混合溶液5μl滴于损伤跟腱处,观察FGF9对小鼠术后跟腱HO的影响。在VEGF-c实验中将人重组VEGF-c（Peprotech公司）（0或0.1μg）Matrigel混合溶液5μl滴加于雄性小鼠损伤跟腱局部,观察VEGF-c对小鼠术后跟腱HO的影响。研究结果1.FGFR3Col2小鼠跟腱切断术后获得性HO较对照组显著加重;10周龄FGFR3Col2小鼠及FGFR3f/f小鼠连续5天注射他莫昔芬,之后行跟腱切断手术。术后每2周通过X光检测跟腱HO发生情况,FGFR3f/f小鼠术后2、4、6、8周跟腱HO发生率为4.3%（1/23）、13.0%（3/23）、47.8%（11/23）、78.3%（18/23）,FGFR3Col2小鼠损伤跟腱HO发生率分别为18.2%（4/22）、22.7%（5/22）、68.2%（15/22）、95.5%（21/22）。跟腱切断术后4周micro-CT检测发现FGFR3Col2小鼠HO较对照组加重,病理染色显示FGFR3Col2小鼠较对照组损伤跟腱内异位软骨显著增加,免疫组化、q PCR、WB检测发现FGFR3Col2小鼠跟腱内软骨、成骨相关标志物如Sox9、ACAN、Osx、Runx2较FGFR3f/f小鼠均显著增加。术后8周micro-CT检测发现FGFR3Col2小鼠损伤跟腱内异位骨较对照小鼠明显加重,病理染色显示FGFR3Col2小鼠较对照组跟腱内异位骨显著增加,免疫组化、q PCR、WB检测发现FGFR3Col2小鼠损伤跟腱软骨、成骨相关标志物如Sox9、ACAN、Runx2、OC较对照小鼠均显著增加。2.Col2+细胞没有直接参与HO形成,而是参与损伤跟腱新生淋巴管生成;Col2tomato小鼠、FGFR3f/f-Col2tomato小鼠跟腱切断术8周后免疫荧光检测发现损伤跟腱中tomato+细胞未与Sox9或Runx2共染,提示Col2+谱系细胞未直接参与HO形成。H&E染色发现损伤跟腱中有新生血管生成,CD31免疫荧光染色发现Col2+谱系细胞与新生血管明显分开。进一步研究发现Col2tomato小鼠跟腱中tomato+细胞明显共染LEC标志分子LYVE1,同时疏松结缔组织和正常跟腱腱鞘膜中Col2+谱系细胞共染LYVE1。Col2m Tm G小鼠术后8周通过免疫荧光检测发现LEC标志分子LYVE1、Prox1、PDPN均与Col2+谱系细胞明显共染。Col2tomato小鼠他莫昔芬注射1天之后发现Col2+谱系细胞存在于正常跟腱腱鞘膜中,损伤8周后跟腱和腱鞘膜中Col2+谱系细胞明显共染LYVE1。Col2tomato小鼠他莫昔芬注射8周后,tomato+细胞分布于骨髓腔中,且参与小鼠足底部分肌肉形成,术后8周损伤跟腱中tomato+细胞共染间充质干细胞标志分子α-SMA。Tomato小鼠、Col2tomato小鼠、m Tm G小鼠、Col2m Tm G小鼠未注射他莫昔芬术后8周损伤跟腱中已有新生LYVE1+LEC,但未发现reporter阳性细胞存在。Col2m Tm G小鼠注射他莫昔芬跟腱切断手术8周损伤跟腱分离原代细胞免疫荧光检测发现GFP+细胞明显共染LEC标志分子LYVE1、Prox1、VEGFR3,而m Tm G小鼠、Col2m Tm G小鼠未注射他莫昔芬损伤跟腱原代细胞未检测到GFP+细胞。Col2tomato小鼠、FGFR3f/f-Col2tomato小鼠术后8周损伤跟腱中tomato+细胞与LYVE1共染,不与F4/80共染。Prx1tomato和FGFR3f/f-Prx1tomato小鼠术后8周跟腱HO中tomato+细胞与Sox9共染,不与LYVE1共染。Prx1tomato和FGFR3f/f-Prx1tomato小鼠损伤跟腱中LYVE1+LEC数量无显著差异。3.FGFR3Prox1小鼠跟腱切断术后获得性HO较对照组显著加重;FGFR3Prox1小鼠跟腱切断术后4周和8周X光、CT检测发现跟腱HO较对照组小鼠均显著加重。病理染色可见术后4周FGFR3Prox1小鼠跟腱中异位软骨较对照组显著增加,免疫组化检测可见FGFR3Prox1小鼠跟腱HO中Sox9、Osx水平较FGFR3f/f小鼠显著提高。病理染色可见术后8周FGFR3Prox1小鼠跟腱HO较对照小鼠显著加重,FGFR3Prox1小鼠损伤跟腱HO的Runx2、OC水平较对照小鼠显著增加。4.LEC中FGFR3缺失抑制损伤跟腱淋巴管生成、加重局部炎症水平;Col2tomato小鼠、FGFR3f/f-Col2tomato小鼠术后4周、8周损伤跟腱共染LYVE1,发现敲除FGFR3后Col2+细胞形成的LEC数量显著减少,q PCR检测LEC相关标志分子发现FGFR3Col2小鼠损伤跟腱淋巴管生成较对照组明显减少。免疫荧光检测发现FGFR3Prox1小鼠术后8周跟腱LYVE1+LEC数量较对照小鼠显著减少。ICG NIR检测淋巴管引流功能发现FGFR3Col2小鼠和FGFR3Prox1小鼠损伤跟腱淋巴引流水平显著降低。共染F4/80和i NOS发现敲除FGFR3小鼠术后4周、8周损伤跟腱促炎巨噬细胞水平较对照小鼠显著增多。病人HO标本病理染色发现成熟期HO（创伤后12-18个月）中已经形成成熟骨小梁和骨髓腔,而成骨期HO（创伤后3-6个月）主要为软骨和少量骨组织。免疫荧光染色发现成熟期HO较成骨期HO中LYVE1+LEC表达的FGFR3水平显著降低,且LEC数量也显著减少,同时F4/80+i NOS+促炎巨噬细胞数量显著增多。免疫荧光检测发现野生型小鼠术后12周损伤跟腱LYVE1+LEC数量较术后8周显著减少,同时促炎巨噬细胞数量显著增多。5.LEC中FGFR3缺失能够上调BMPR1a-p Smad1/5信号通路;免疫荧光检测显示FGFR3f/f-Col2tomato小鼠较Col2tomato小鼠术后8周损伤跟腱LYVE1+LEC中FGFR3表达水平显著降低,而BMPR1a、p Smad1/5表达水平显著增高。WB检测发现小鼠LEC细胞系中敲降FGFR3后BMPR1a、p Smad1/5表达水平明显增高,而Smad1/5表达无明显变化。同时FGFR3Prox1小鼠损伤跟腱LYVE1+LEC中FGFR3表达水平较FGFR3f/f小鼠明显降低,而BMPR1a、p Smad1/5表达水平明显增高。6.FGFR3缺失小鼠敲除BMPR1a后能够促进损伤跟腱淋巴管生成抑制HO形成;X光检测发现FGFR3Col2;BMPR1af/+、FGFR3Col2;BMPR1af/f小鼠术后2、4、6、8周跟腱HO发生率较FGFR3Col2小鼠明显降低,通过micro-CT检测发现FGFR3Col2小鼠敲除BMPR1a后跟腱切断术4周、8周HO体积明显减少,H&E和SOFG染色提示术后4周FGFR3Col2;BMPR1af/+小鼠和FGFR3Col2;BMPR1af/f小鼠跟腱中异位软骨较FGFR3Col2小鼠明显减少,损伤跟腱中Sox9、Osx表达水平明显降低。病理染色和组织形态学计量显示术后8周FGFR3Col2;BMPR1af/+、FGFR3Col2;BMPR1af/f小鼠跟腱HO较FGFR3Col2小鼠明显减少,免疫组化检测跟腱HO中OC表达显著减少。FGFR3Prox1;BMPR1af/+小鼠、FGFR3Prox1;BMPR1af/f小鼠跟腱切断术后8周与FGFR3Prox1小鼠相比,micro-CT检测发现HO体积显著减少,病理染色及组织形态学计量同样显示跟腱HO体积显著减少,而跟腱HO中OC表达明显降低。免疫荧光检测提示FGFR3、BMPR1a双敲小鼠损伤跟腱中LYVE1+LEC数量与FGFR3敲除小鼠相比显著增多,而跟腱局部F4/80+i NOS+促炎巨噬细胞数量显著减少。7.FGF9抑制获得性HO形成依赖于LEC的FGFR3;野生小鼠跟腱切断术后给予0.01、0.1、1 ug剂量FGF9局部缓释治疗,8周后micro-CT和SOFG病理染色检测发现跟腱HO体积均明显减少,且HO中Sox9、OC表达水平均显著减少。LYVE1免疫荧光结果提示FGF9治疗后损伤跟腱新生LEC数量增多,且跟腱淋巴管引流功能增强,跟腱局部促炎巨噬细胞数量显著减少。而FGFR3Prox1小鼠给予FGF9治疗后HO体积及损伤跟腱LEC数量均无明显变化。8.VEGF-c促进损伤跟腱淋巴管生成抑制HO形成;野生小鼠跟腱切断术后给予VEGF-c局部缓释治疗后micro-CT检测发现跟腱HO体积显著减少,SOFG染色发现跟腱中HO形成明显抑制,免疫荧光检测发现VEGF-c治疗显著增加损伤跟腱中LYVE1+LEC数量,同时局部F4/80+i NOS+促炎巨噬细胞数量显著减少。研究结论1.Col2+细胞作为LEC前体细胞参与损伤跟腱中淋巴管生成;2.FGFR3在LEC中敲除通过抑制损伤跟腱新生淋巴管形成,加重损伤局部炎症水平,进而促进获得性HO形成;3.LEC中敲除FGFR3通过上调BMPR1a-p Smad1/5信号通路抑制跟腱损伤后新生淋巴管生成;4.靶向激活LEC中FGFR3能够抑制获得性HO的形成。