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目的:在体外成功分离、培养及鉴定大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow me senchymal stem cells,BM MSCs)及成功利用肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)刺激结肠腺癌细胞Caco-2建立体外肠黏膜上皮损伤模型的基础上,探讨趋化因子受体CX3CR1在BM MSCs修复受损肠上皮细胞间紧密连接中所发挥的作用。方法:1.体外贴壁筛选法分离培养大鼠BM MSCs至3代,观察BM MSCs的细胞形态、流式检测细胞表型、成脂成骨诱导分化方法检测BM MSCs的分化能力。2.使用Caco-2模拟肠黏膜上皮细胞,免疫荧光、RT-PCR和Western blot技术检测紧密连接蛋白ZO-1和Occludin来评价Caco-2的肠道屏障功能。将TNF-α以0 ng/m L、50 ng/m L、100 ng/m L和200 ng/m L四种不同浓度处理Caco-2,探索TNF-α作用Caco-2的最佳损伤浓度;选择造模最佳浓度点作用Caco-2细胞,作用时间分别为0 h、12 h、24 h和48 h,筛选TNF-α作用Caco-2的最佳损伤时间,从而摸索出建立稳定肠黏膜上皮损伤模型的最佳条件。3.将BM MSCs与受损Caco-2通过transwell小室间接共培养,采用RT-PCR和Western blot技术检测Caco-2细胞上ZO-1和Occludin以及BM MSCs上CX3CR1的含量变化。4.用CX3CR1抗体孵育封闭BM MSCs上CX3CR1受体,将anti-CX3CR1-BM MSCs与受损Caco-2通过Transw ell小室共培养,RT-PCR和Western blot技术检测Caco-2细胞上ZO-1和Occludin的含量变化,进一步明确CX3CR1在BM MSCs修复受损肠上皮细胞间紧密连接中所发挥的作用。结果:1.体外成功提取培养BM MSCs。镜下BM MSCs贴壁成长,呈长梭形,似漩涡或菊花状排列,具备典型MSCs的形态特征。流式检测三代BM MSCs,93.0%的细胞表达CD90而不表达CD45,97.5%的细胞表达CD29而不表达CD34,97.0%的细胞表达RT1A而不表达RT1B,这说明我们提取的原代细胞培养至三代可以获得极纯的BM MSCs,几乎没有造血干细胞等混杂。将三代BM MSCs使用成脂诱导培养液培养后,油红O染色细胞质内出现橘红色脂滴,BM MSCs使用成骨诱导培养液培养后,Von Kossa染色细胞内出现黑色钙盐沉积。这些提示我们:采用贴壁筛选法提取的BM MSCs,正是我们需要的目的细胞。2.应用不同浓度及不同作用时间的TNF-a处理Caco-2,免疫荧光检测可见正常Caco-2中ZO-1连接呈蜘蛛网状,随着TNF-a浓度的增加、作用时间的延长,ZO-1网状结构遭到破坏、荧光强度减弱,RT-PCR和Western blot检测结果显示随着TNF-a作用浓度的增大、作用时间的延长,ZO-1、Occludin的表达水平降低越来越明显,呈浓度依赖和时间依赖,而100 ng/m L和200 ng/m L TNF-a对Caco-2中ZO-1、Occlud in的表达影响差异无统计学意义,最终证实本实验条件下TNF-α的最佳造模浓度为100 ng/m L,造模时间为48 h。3.BM MSCs与受损Caco-2共培养后,RT-PCR结果显示:ZO-1、Occludin m RNA的表达水平较受损Caco-2组增加,同时BM MSCs上CX3CR1 m RNA的表达量较正常BM MSCs组增加,具有统计学意义;Western blot结果显示:ZO-1、Occludin蛋白的表达水平较受损Caco-2组增加,同时BM MSCs上CX3CR1蛋白的表达量较正常BM MSCs组增加,具有统计学意义。m RNA水平与蛋白水平结果一致。提示:BM MSCs具有修复受损肠上皮细胞间紧密连接的作用。4.Anti-CX3CR1-BM MSCs与受损Caco-2共培养后,RTPCR结果显示:ZO-1、Occludin m RNA的表达量较阻断CX3CR1前减少,但高于受损Caco-2组的表达量。Western blot结果显示:ZO-1、Occludin蛋白的表达量较阻断CX3CR1前减少,但高于受损Caco-2组的表达量。揭示了BM MSCs上趋化因子受体CX3CR1参与其修复受损肠上皮细胞间紧密连接。结论:1.采用贴壁筛选法可以成功提取、培养获得纯度高、数量多的大鼠BM MSCs,该方法简单易行。2.在体外环境下,使用100 ng/ml TNF-α作用48h刺激Caco-2细胞,可成功建立稳定的肠黏膜上皮损伤模型。3.BM MSCs表面CX3C R1高表达促进受损肠黏膜上皮间紧密连接蛋白及m RNA的表达,发挥保护肠黏膜上皮细胞的作用。封闭BM MSCs上CX3CR1受体后,BM MSCs修复肠上皮紧密连接蛋白及m RNA表达的作用减弱,证实CX3CR1在BM MSCs修复受损肠黏膜上皮间紧密连接中发挥作用。