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目的探索体外扩增白血病肿瘤相关抗原特异性细胞毒T细胞(tumor-associated antigen-specific cytotoxic T lymphocytes,TAA-CTLs)的可行性,并在体外验证其特异性杀伤作用。方法与健康志愿者签署知情同意书后,采集正常健康志愿者外周血10-20ml,采用密度梯度离心法,利用人淋巴细胞分离液得到外周血单个核细胞,显微镜(5×)下计数单个核细胞数。采用“细胞因子鸡尾酒法”【r IL-4(400U/ml),GM-CSF(800U/ml),PGE-2(1ug/ml),TNF-α(10ng/ml),r IL-1β(10ng/ml)、r IL-6(100ng/ml)】诱导培养树突状细胞(Dendritic cells,DCs),倒置显微镜观察并采集成熟DC形态,流式细胞仪分析成熟及非成熟DCHLA-DR及CD86表型差异。成熟的DC负载白血病相关抗原WT1、PRAME、NY-ESO-1混合多肽,后与自体T淋巴细胞共培育,扩增出TAA-CTL;同时设置未经多肽致敏的DC与自体T淋巴细胞共培育,扩增出CTLs作为对照组。采用流式细胞仪检测TAA-CTLs表型及多种细胞因子的分泌率(IFN-γ、TNF-a、IL-2、IL-4、IL-10),细胞毒实验检测TAA-CTLs对负载肿瘤相关抗原的自体靶细胞的杀伤力。结果1)外周血单个核细胞经GM-CSF、IL-4联合作用3天后细胞发展为不规则形态并聚集成团,部分细胞由贴壁状态变为悬浮状态。培养7天诱导成熟后,镜下见大部分细胞变为悬浮状态,细胞体积变大,形态不规则且有大量毛刺状突起。流式细胞术检测表明经成熟诱导后的成熟DC细胞表面HLA-DR和CD86的表达明显上调。2)体外诱导培养的TAA-CTLs扩增倍数为3.81±1.61,流式细胞术检测其中CD3+细胞平均为(97.22±0.71)%,CD3+CD4+占(41.47±27.08)%,CD3+CD8+占(56.40±11.15)%,CD3-CD56+占(0.50±0.31)%,CD19+仅占(0.14±0.20)%,与对照组细胞表型分析比较差异无统计学意义(P>0.05)。3)流式细胞术检测TAA-CTLs分泌的多种细胞因子,如图4所示:与对照组相比,TAA-CTLs中,IFN-γ和TNF-a的分泌明显增高。其中CD8+TAA-CTLs中IFN-γ和TNF-a的分泌率分别为(27.67±2.21)%和(34.2±0.71)%;CD4+TAA-CTLs中IFN-γ和TNF-a的分泌率分别为(21.6±2.55)%和(9.97±3.44)%。而对照组中,CD8+CTLs细胞中,IFN-γ和TNF-a的分泌率分别为(1.36±0.04)%、(5.58±0.03)%;CD4+CTLs细胞中,IFN-γ和TNF-a的分泌率分别为(0.91±0.06)%和(1.60±0.07)%,均明显低于TAA-CTLs组(P<0.01)。相反,与对照组相比,CD4+TAA-CTLs【(0.97±0.08)%vs(6.44±0.37)%】)和CD8+TAA-CTLs【(0.97±0.11)%vs(6.37±0.18)%】中,IL-4的分泌明显降低(P<0.01)。而IL-10的分泌率两组间无明显差异。CD107a是T细胞活化的重要标志,与细胞脱颗粒作用密切相关。流式细胞术结果显示:与对照组相比,CD8+TAA-CTLs中,CD107a的表达率明显升高【(27.95±0.55)%vs(18.55±0.35)%】(P<0.01),而CD4+TAA-CTL中CD107a的表达与对照组无明显差异【(11.3±0.17)%vs(13.5±0.12)%】4)TAA-CTLs在效靶比为5:1、10:1、20:1、40:1时对负载TAA的自体靶细胞的杀伤率分别为(26.85±5.25)%、(60.55±2.45)%、(67.4±3.60)%、(77.00±1.00)%,对未负载TAA的自体靶细胞未见明显杀伤作用(p<0.01)。结论来源于健康志愿者的外周血单个核细胞体外可以成功诱导扩增出TAA-CTLs并具有特异性杀伤功能。