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小胶质细胞是驻扎在中枢神经系统(central nervous system,CNS)的单核巨噬细胞,约占脑胶质细胞总数的10-20%。小胶质细胞作为脑内免疫刺激的第一道防线,功能主要为吞噬、抗原递呈与产生细胞因子。一般将小胶质细胞简单分为“静息态”和“激活态”。然而“静息态”的小胶质细胞并非真正意义上的功能静息,双光子显微镜发现,即使是“静息态”的小胶质细胞也呈高度动态性,其突起处于不断的运动之中,伸缩覆盖较大的范围,严格监控着CNS微环境。一旦遇到外来物质或者伤害性因子,小胶质细胞会迅速转为“激活态”,合成并释放大量的炎性因子和神经毒性物质,这些因子包括:肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β),白细胞介素6(IL-6),前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)、一氧化氮(nitric oxide,NO)、活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)等,主要作用是调节CNS的固有免疫,并启动中枢炎症。生理情况下,适当的中枢炎症水平可的保护CNS内环境的稳态,然而,长期持续和级联放大的中枢炎症会引起CNS内环境失调,导致神经退行性病理过程的发生。因此,小胶质细胞活化是神经退行性病变病理过程的重要研究靶点。组胺在过敏反应和胃肠道炎症中的重要作用已被我们所熟知,CNS中也含有组胺能神经元,其与睡眠、进食、注意力和认知密切相关。组胺由组氨酸脱羧酶合成,其通过组胺四类亚型受体发挥作用,如histamine 1 receptor(H1R)、H2R、H3R和H4R,这四类受体均为G蛋白耦联受体。H1R和过敏反应密切相关,其激活可导致毛细血管扩张、通透性增加,平滑肌痉挛。H2R与胃壁细胞分泌胃酸及支气管等腺体分泌增加有关。H3R分布于中枢和外周神经末梢,调节组胺和其他神经递质的合成与释放。H4R是最晚发现的组胺受体,可介导T细胞等免疫细胞释放细胞因子。我们课题组前期研究发现小胶质细胞上也含有组胺四类亚型受体,组胺可通过H1R/H4R-PI3K/AKT/MAPK-NF-κB信号通路激活小胶质细胞。然而,小胶质细胞上组胺四类亚型受体各自在中枢炎症中的作用尚不明确。因此,本研究将在离体和在体两个层面探讨小胶质细胞组胺四类亚型受体在内毒素(lipopolysaccharide,LPS)诱导的中枢炎症中的作用。第一部分离体研究组胺受体与小胶质细胞活化及炎性因子释放的关系目的:离体研究组胺受体在LPS诱导小胶质细胞活化中的作用方法:1.使用流式细胞仪检测LPS(10 ng/m L)刺激下原代培养大鼠小胶质细胞上组胺四类受体亚型的表达。2.首先使用浓度分别为0.001、0.01、0.1、1μg/m L的组胺和LPS共刺激小胶质细胞24小时,ELISA法检测细胞上清中炎症因子TNF-α的表达。其次,使用浓度为1μg/m L的组胺和LPS共刺激小胶质细胞1.5、3、6、12、24 h,ELISA法检测细胞上清中TNF-α的表达。3.在使用LPS刺激小胶质细胞之前30 min,分别用浓度为0.1、1、10、100μM的组胺受体拮抗剂孵育小胶质细胞,24 h后采用ELISA法检测细胞上清中TNF-α的表达。然后在LPS和组胺共刺激小胶质细胞之前,分别用浓度为10μM的组胺受体拮抗剂孵育小胶质细胞,24 h后采用ELISA法检测细胞上清中TNF-α的表达。4.在使用LPS刺激小胶质细胞之前30 min,分别用浓度为0.1、1、10、100μM的组胺受体激动剂孵育小胶质细胞,24 h后采用ELISA法检测细胞上清中TNF-α的表达。结果:1.LPS(10 ng/m L)可使小胶质细胞上H2R和H3R表达上调,而H1R和H4R表达无变化。2.LPS(10 ng/m L)刺激小胶质细胞24小时明显诱导其释放TNF-α,组胺亦可呈剂量依赖性诱导小胶质细胞TNF-α的释放。但当两者共同作用于小胶质细胞时,组胺(0.1和1μg/m L)可以部分抑制LPS引起的TNF-α生成增加。3.H1R拮抗剂cetirizine(1μM以上)和H4R拮抗剂A943931(10μM以上)能够部分阻断LPS(10 ng/m L)引起的小胶质细胞TNF-α的释放,然而H2R拮抗剂ranitidine和H3R拮抗剂carcinine(1μM以上)对LPS引起的小胶质细胞TNF-α的释放有协同作用。且H2R拮抗剂ranitidine和H3R拮抗剂carcinine能够部分阻断组胺对LPS诱导TNF-α生成的抑制作用。4.H1R激动剂2-pyridylethlamine(1到100μM)作用24小时可以协同LPS促进小胶质细胞释放炎性因子TNF-α。该作用可以被相应的受体拮抗剂所阻断。H2R激动剂amthamine和H3R激动剂(R)-(-)-α-methylhistamine(1到100μM)可以部分抑制LPS引起的小胶质细胞释放TNF-α,H2R和H3R拮抗剂可以阻断该作用。然而H4R激动剂4-methylhistamine对LPS引起的TNF-α释放无显著作用。结论:本研究利用离体培养的原代小胶质细胞在LPS刺激条件下,观察到H1R和H4R在小胶质细胞中的促炎作用,H2R和H3R在小胶质细胞中的抗炎作用,组胺通可过激活H2R和H3R部分抑制LPS诱导的小胶质细胞TNF-α的释放。第二部分在体探讨组胺受体对LPS致急性中枢炎症的影响目的:在体探讨组胺受体在LPS致急性中枢炎症中的作用方法:1.腹腔注射LPS(10μg/kg),0.5、8、24 h后处死Wistar大鼠,使用高效液相分析检测下丘脑和皮层中组胺的含量。2.腹腔注射LPS,不联合或联合侧脑室定位注射组胺(80μg),8和24 h后处死大鼠,免疫组化检测皮层区小胶质细胞的活化数量。3.单独腹腔注射LPS、单独侧脑室定位注射组胺或两者联合,0.5、8、24、72h后处死大鼠,ELISA法检测皮层区TNF-α、IL-1β和IL-10的含量。4.在腹腔注射LPS之前30 min,侧脑室立体定位给予组胺受体激动剂或拮抗剂,8h后处死大鼠,ELISA法检测皮层区TNF-α、IL-1β和IL-10的表达。结果:1.LPS(10μg/kg)腹腔注射30分钟后,即可使下丘脑组胺水平升高,并于8和24 h组胺水平显著升高且趋于平稳。而大脑皮层组织的组胺水平,在LPS腹腔注射30 min无显著变化,8和24 h后组胺水平升高且有统计学意义。2.单独腹腔注射LPS(10μg/kg)8和24 h,皮层区小胶质细胞的活化数量明显增多,而同时联合侧脑室给予组胺(80μg)可部分抑制LPS引起的小胶质细胞活化。3.H1R激动剂2-pyridylethlamine协同LPS促进促炎因子释放,拮抗剂cetirizine则相反;H2R激动剂amthamine和H3R激动剂(R)-(-)-α-methylhistamine抑制LPS引起的中枢炎症,并增加IL-10的表达,拮抗剂ranitidine和carcinine则相反。结论:在体实验中,H2R和H3R在LPS诱导的Wistar大鼠中枢炎症中表现为抗炎作用,H1R表现为促炎作用,H4R的作用不明显。