背景及目的：
　　肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是常见的恶性肿瘤之一，尤其在我国特别高发，其死亡率居恶性肿瘤第三位。肝癌是一种炎症相关肿瘤，慢性炎症贯穿肝癌发生发展始终，许多慢性病毒肝炎、非酒精性脂肪肝及酒精肝都可能会发展成肝癌。肝癌多在肝纤维化及肝硬化等慢性肝损伤的基础上形成。肝纤维化是许多慢性肝病共同的病理过程，是慢性炎症引起机体对于损伤的一种修复反应。若损伤因素长期存在，肝纤维化则会进一步发展成肝硬化，而将近三分之一的肝硬化患者最终会发展成为肝癌。因此，研究慢性炎症诱发肝纤维化以及肝纤维化如何演变成肝癌对于肝癌的预防具有重要的意义。
　　肌成纤维细胞是肝纤维化形成的主要效应细胞，其主要来源于活化的肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)。最新的研究表明肝前体细胞(hepatic progenitor cells，HPCs)也可以分化为肌成纤维细胞。HPCs是一类具有双向分化潜能的未成熟细胞，其在生理条件下可通过肝向和胆向分化参与肝脏慢性损伤的修复过程。而在病理条件下也被认为是肿瘤起始细胞的重要来源，参与肝癌的发生。然而，慢性炎症微环境中，HPCs参与肝癌发生的机制以及影响HPCs异常分化的因素目前尚不够明确。
　　越来越多研究表明，慢性肝损伤是导致肝癌发生的重要病理过程。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是由革兰氏阴性菌死亡后的胞壁崩解自溶释放产生，具有多种生物活性。生理条件下，由肠道细菌产生的LPS通过肠粘膜进入毛细血管后经门静脉进入肝脏后被解毒清除。慢性肝损伤过程中，由于门脉高压及胆汁代谢异常引起肠道的渗透性增加，导致肠道菌群紊乱，从而使肠道中更多的LPS通过门静脉进入肝脏，导致LPS在“肝炎-肝硬化-肝癌”这一所谓“肝癌三部曲”中持续升高。LPS是重要的促炎因子，可以促进炎症因子如白介素-1β(interleukin-1-beta，IL-1β)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、白介素-8(interleukin-8，IL-8)，白介素-12（interleukin-12，IL-12），干扰素(typeⅠinterferons，IFNs))，转化生子因子(tranforming growth factor-beta，TGF-β)以及肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）的产生。因此，LPS在肝纤维化及肝癌发生中都扮演重要角色。然而LPS对HPCs功能的影响，目前研究较少。探索LPS及HPCs对肝癌发生的作用并研究LPS对HPCs功能的影响及机制，不仅有助于我们认识肿瘤微环境中炎症与HPCs的相互作用对肝癌发生的影响，还可为进一步的微环境干预研究提供理论依据。
　　本课题我们首先利用肝癌临床标本和大鼠原发性肝癌动物模型观察了HPCs的激活、肝纤维化程度与肝癌发生之间的相关性，发现HPCs的激活与肝纤维化的形成及肝癌的发生密切相关。我们在DEN诱导的大鼠原发性肝癌模型中通过外源性输注HPCs，研究HPCs对肝癌发生的影响，发现外源性HPCs的输注促进了肝纤维化的形成及肝癌的发生，LPS在上述过程中发挥了重要作用。此外，实验结果提示LPS并不能直接诱导HPCs形成肿瘤，而是诱导HPCs向肌成纤维细胞转化，在此基础上肌成纤维细胞可进一步诱导HPCs形成肿瘤。相关机制研究发现，LPS诱导的HPCs来源的肌成纤维细胞通过分泌IL-6和TNF-α，进一步诱导HPCs中Ras信号通路的激活和p53信号通路的失活从而最终促进HPCs的增殖和异常转化。此外，通过将肝癌临床样本中IL-6和TNF-α表达水平与激活的HPCs、肝纤维化水平及肝癌复发进行相关性分析后发现，IL-6和TNF-α与上述指标都密切相关。我们的研究结果提示，肝癌微环境中的肌成纤维细胞和肝癌细胞均可能来源于HPCs。HPCs源性肌成纤维细胞参与构成肿瘤微环境，促进HPCs的增殖和异常转化。LPS不仅参与诱导了肝脏慢性炎症微环境形成，同时也在调控HPCs可塑性进而促进肝癌发生中发挥了重要作用。
　　第一部分:肝前体细胞与肝纤维化及肝癌发生的相关性研究
　　首先，我们利用大鼠DEN原发性肝癌模型及肝癌临床组织标本，观察诱癌不同时期肝脏组织纤维化水平与HPCs激活的相关性，并观察肝癌临床标本的癌旁组织中纤维化水平与HPCs激活的相关性。实验结果发现在诱癌过程中，HPCs激活数量越多，纤维化水平越高，并且HPCs激活与纤维化水平存在相关性。此外，在肝脏癌旁组织中，同样存在这一现象，并且纤维化水平及HPCs激活数量都与患者生存期存在相关性，HPCs激活数量越多，肝癌患者预后越差。为了进一步明确HPCs在肝癌发生中的作用，我们利用大鼠DEN原发性肝癌模型，通过外源输注HPCs，观察其对肝癌发生、肝功能及生存期的影响。结果显示，HPCs输注促进了肝脏肿瘤的发生，肝损伤加剧，同时生存期缩短。进一步病理组织检测发现，HPCs输注促进肝脏纤维化水平，表现为纤维结缔组织增多及α-SMA表达升高。为了探讨外源HPCs输注后在肝脏部位的分布，我们利用GFP标记的慢病毒载体转染HPCs细胞，再将GFP标记的HPCs输注到诱癌大鼠体内。结果发现，GFP阳性的HPCs多趋化至肝脏间质部位，并呈现α-SMA表达阳性。上述结果提示:肝癌发生过程中HPCs的数量与肝纤维化水平存在相关性。在肝癌发生中，HPCs可以促进肝脏纤维化及肿瘤的发生，并有可能向肌成纤维细胞分化。
　　第二部分:脂多糖诱导肝前体细胞异常分化参与肝癌微环境形成的作用
　　肝癌发生过程中，外周血LPS浓度持续升高，那么LPS是否参与HPCs对肝纤维化及肝癌发生的作用？我们利用大鼠DEN原发性肝癌模型，通过四联抗生素清除LPS，再观察外源HPCs输注对肝纤维化及肝癌发生，肝功能及生存期的影响。结果发现，清除LPS后，大鼠肝癌发生被抑制，肝功能好转，同时肝癌大鼠的生存期延长。进一步组织病理检测发现，抑制LPS后，肝纤维化水平也随之降低。为了进一步明确LPS对HPCs功能的影响，我们利用LPS处理HPCs细胞系，采用转录组测序技术分析LPS对HPCs基因表达的影响，发现纤维化相关基因的表达被上调，而LPS对HPCs中肿瘤相关基因的表达没有影响。为了进一步证实这一现象，我们输注到诱癌大鼠体内的GFP标记的HPCs分选出来，通过RT-PCR及Western Blot技术检测发现，GFP阳性细胞中肌成纤维细胞相关基因表达上调。这一结果证实了第一部分研究中提出的HPCs可能向肌成纤维细胞分化的假设。此部分结果提示LPS可诱导HPCs向肌成纤维细胞分化从而参与肝纤维化的形成。
　　第三部分:脂多糖诱导肝前体细胞异常分化参与肝癌微环境形成的机制
　　前两部分研究证实了HPCs参与肝纤维化及肝癌发生，LPS在诱导HPCs分化为肌成纤维细胞中发挥重要作用。为了进一步探讨HPCs源性的肌成纤维细胞对肝癌发生的影响，我们将LPS处理后的HPCs与正常HPCs混合后接种裸鼠皮下，结果发现有肿瘤形成，而作为对照组的正常HPCs接种组和LPS预处理HPCs接种组并未见肿瘤形成。这一结果表明HPCs来源的肌成纤维细胞可能参与了肝癌发生相关微环境的构成，导致了HPCs的异常分化，促进了肝癌发生。在进一步的机制研究中，我们分别利用正常HPCs及LPS处理后的HPCs条件培养上清去处理HPCs，细胞增殖实验显示LPS处理后的HPCs条件培养上清可较对照组明显促进正常HPCs的增殖。我们通过Bioplex细胞因子芯片检测，发现LPS处理HPCs分化为肌成纤维细胞之后，炎症因子IL-6及TNF-α的表达升高。进一步通过基因芯片检测发现，LPS诱导的HPCs来源的肌成纤维细胞上清激活了HPCs中肿瘤相关信号通路Ras的表达，同时抑制了抑癌信号通路p53的表达。该结果提示，HPCs来源的肌成纤维细胞分泌了大量IL-6及TNF-α，而IL-6和TNF-α进一步诱导HPCs中Ras和p53信号通路的异常表达，促进HPCs异常分化从而导致肝癌发生。最后，通过将肝癌临床样本中IL-6和TNF-α表达水平与HPCs的激活、肝纤维化水平及肝癌复发进行相关性分析后发现，IL-6和TNF-α与上述指标均密切相关。
　　综上所述，本研究结果证实，LPS在肝脏炎症损伤过程中持续升高并可诱导HPCs分化为肌成纤维细胞，而LPS诱导的HPCs来源的肌成纤维细胞通过分泌IL-6和TNF-α诱导HPCs中Ras和p53信号通路的异常表达，最终通过HPCs的恶性增殖及转化导致了肝癌的发生。