呼吸道合胞病毒(RSV)是全球范围内引起婴幼儿肺炎、毛细支气管炎等下呼吸道感染的重要病原体,可引起或加重儿童哮喘,是婴幼儿住院的主要病因,严重者甚至可导致死亡。RSV也可引起成人严重的呼吸系统疾病,特别是老年人及免疫缺陷病患者。目前临床上尚无特异性针对其的抗病毒药物,所以开发研究新的治疗RSV药物及疫苗已成为全球迫在眉睫的需要。重组人干扰素α1b(rh INF-α1b)抗病毒及免疫调节等作用已被越来越多的学者研究证实,最近其作用于RSV的研究被积极开展,前期我们已有部分实验表明rh INF-α1b对RSV的抗病毒作用,但其作用机制尚不明确。据文献报道JAK/STAT、TLR4/NF-κB等信号通路与RSV感染有密切的相关性。因此,我们推测这些信号通路与RSV感染的致病机制及rh INF-α1b干预治疗的效果可能有着一定的相关性。目的本课题通过rh INF-α1b不同剂量的雾化吸入给药及腹腔注射给药,采用光镜下观察病理学改变、免疫荧光法观察STAT1、STAT2蛋白的表达及免疫组化法观察TLR4和NF-κB蛋白的表达,探讨rh INF-α1b不同剂量及给药方式对RSV感染小鼠的抗病毒作用及对JAK/STAT和TLR4/NF-κB信号通路的影响。方法(1)Hep-2细胞培养、传代、计数及冻存。(2)RSV病毒增殖,并收集病毒悬液。(3)提取病毒悬液RNA,检测病毒RNA纯度及完整性。(4)RT-PCR鉴定RSV核酸,检测病毒TCID50。(5)将48只BALB/c小鼠随机分为6组(每组8只):阴性对照组,RSV感染模型组,rh INF-α1b 12.5μg雾化吸入组,rh INF-α1b 25μg雾化吸入组,rh INF-α1b 50μg雾化吸入组,rh INF-α1b 12.33μg/kg腹腔注射组。(6)除阴性对照组小鼠外,对其余各组小鼠进行RSV病毒悬液滴鼻,建立RSV小鼠感染模型。(7)连续5天药物干预治疗,于第6天无菌剖取小鼠左肺组织,于4%甲醛溶液中固定48 h,石蜡包埋,切片。(8)通过HE染色切片,在光镜下观察各组小鼠肺组织病理学改变。(9)通过免疫荧光染色,在免疫荧光显微镜下观察STAT1和STAT2蛋白表达情况。(10)通过免疫组化法染色,在光镜下观察TLR4和NF-κB蛋白表达情况。结果(1)Hep-2细胞培养,RSV病毒悬液收集成功,纯度及完整性较好,RSV核酸鉴定明确,TCID50=10-4.3。(2)成功建立RSV感染小鼠模型。(3)光镜下观察,RSV感染模型组小鼠肺组织炎性损伤明显。在rh INF-α1b干预治疗后,各组炎性损伤均有不同程度的改善,其中rh INF-α1b 50μg雾化吸入组炎性损伤程度最轻;病理组织学评分各组间差异均有统计学意义(P<0.05)。(4)免疫荧光显微镜下观察,RSV感染模型组STAT1和STAT2蛋白表达明显减弱,rh INF-α1b干预治疗后可不同程度提高因RSV感染而受到抑制的STAT1和STAT2蛋白表达,rh INF-α1b 50μg雾化吸入组STAT1和STAT2蛋白表达提高最显著,各组间差异均有统计学意义(P<0.05)。(5)光镜下观察RSV感染模型组TLR4和NF-κB蛋白表达明显增强,rh INF-α1b干预治疗后可不同程度下调因RSV感染而激活的TLR4和NF-κB蛋白表达,rh INF-α1b 50μg雾化吸入组STAT1和STAT2蛋白表达下调最显著,各组间差异均有统计学意义(P<0.05)。结论(1)光镜下观察rh IFN-α1b不同剂量的雾化吸入和腹腔注射均可改善RSV感染小鼠的肺组织炎性损伤,提示rh IFN-α1b对RSV感染小鼠具有抗病毒作用。(2)RSV感染的小鼠肺组织细胞中TLR4/NF-κB信号通路的活化,而JAK/STAT信号通路的活性被抑制。给予外源性rh INF-α1b可抑制因受RSV感染激活的TLR4/NF-κB信号通路,提高因受RSV感染抑制的JAK/STAT信号通路活性。在本实验中,给予外源性rh INF-α1b剂量越大,上述通路的信号变化越明显,肺组织炎性损伤越小。提示rh IFN-α1b对RSV感染小鼠具有抗病毒作用并与rh IFN-α1b调节上述信号通路的信号变化有关。(3)rh INF-α1b雾化吸入对RSV感染小鼠治疗效果,优于腹腔注射。(4)rh INF-α1b雾化吸入剂量对RSV感染小鼠治疗效果和上述通路的信号变化的影响,在一定范围内成量-效关系;rh INF-α1b 50μg雾化吸入组治疗效果最佳,对上述通路的信号影响最明显。