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圆形精细胞卵胞质内显微注射(Round spermatid injection,ROSI)辅助生殖技术的出现为治疗人类男性不育提供了新的途径。作为一种动物胚胎工程新技术,ROSI在提高动物配子利用率,获取所需性别的动物个体、解决生产能力差的动物受精问题,尤其在作为转基因工程的辅助技术方面都有重要应用。ROSI技术目前研究并不深入,临床应用成功率非常低,尤其是在动物,仅仅在小鼠、兔、猴等有报道,在猪尚未见产出后代的报道,还处于探索阶段。 猪是多胎动物,从猪卵巢上获得的卵母细胞数量虽然较多,但成熟度比较低;由于ROSI技术是将没有完全发育成熟的单一圆形精细胞直接注入卵胞质内,跳越了精子在穿过透明带和卵质膜等过程中所发生的生理和生化反应;如果卵胞质成熟或活化程度不够,加之圆形未成熟精细胞成熟度比较差等原因,很可能造成ROSI受精的卵母细胞内部激活因子蓄积减少和生成不足,引起精核解聚困难、精圆核不能形成、第二极体不能排出、卵母细胞孤雌发育率增加等,使ROSI显微受精失败。本试验旨在结合猪卵母细胞体外成熟培养及ROSI相关操作,建立卵胞质内圆形精细胞显微注射受精技术程序,探索猪圆形精细胞显微受精的可能性,研究影响这种特殊细胞显微注射受精效果的因素,为进一步研究猪ROSI技术提供基础资料。 本试验首先研究了成熟培养液中添加激素对猪卵母细胞体外成熟过程中染色体构型和成熟率的影响,以探索猪卵母细胞体外成熟规律,提高体外培养成熟度,为ROSI技术体系准备优质卵母细胞;然后针对猪圆形精细胞的体外分离进行了试验,进而通过对ROSI操作和ICSI(Intracytoplasmic sperm injection,ICSI)操作的比较研究了影响ROSI操作的因素。研究结果如下: 试验1:用H33342染色观察COCs在将卵母细胞分别在三种不同培养环境中(FSH→不含激素、FSH→LH、FSH+LH→不含激素。“→”表示在培养的第22~24h换液)其核、质成熟情况。前段培养24h时,含FSH组和含FSH+LH组间除了MI期卵母细胞出现比率差异显著(9.38%vs15.73%;P<0.05)外,其余各分裂阶段的分布差异不显著,但在含FSH中培养24h后,GVI期卵母细胞出现比例低于FH+LH组(12.5%vs20.22%,P>0.05),而GVIV期卵母细胞出现比例则高于FSH+LH组(17.19vs8.99%,P>0.05)。激素对卵母细胞IVM成熟比率的影响:培养48h后,FSH+LH→不含激素组的MII期卵母细胞的出现比率显著高于FSH→不含激素组和FSH→LH组(55.45%vs20.45%、36.62%,P<0.05);FSH→不含激素组GV期卵母细胞的比例显著高于其余两组(22.73%vs9.86%、4.95%,P<0.05);结果表明,猪卵母细胞体外成熟培养中,前24h添加FSH+LH的成熟培养液能够增加GVI期、减少GVIV期卵母细胞的比例,提高了卵母细胞的发育潜力;而且,前24h使用含有FSH+LH的成熟液,后24h使用不含激素体外成熟液能够获得较好的卵母细胞成熟比率。