多种人类疾病都有微血管病变的参与，但是微血管病变在肾脏病中的作用却少有关注。既往对人类疾病和动物模型的研究证明，内皮细胞损伤可导致氧和营养成份运输到肾小管、间质的障碍，引起慢性缺血。慢性缺血继而引起慢性缺氧，从而导致一系列病变，包括：肌成纤维细胞增生、细胞外基质合成和诱导细胞调亡，最终导致肾脏纤维化、肾功能减退。用血管内皮细胞生长因子(VascularEndothelialGrowthFactor,VEGF)治疗大鼠残肾模型促进肾小球和肾小管周围毛细血管内皮细胞增生，可明显改善肾功能，而且胶原Ⅲ合成减少。因此，维护微循环的稳定对肾功能保护有重要意义，改善微血管病变可以延缓肾功能减退。 既往对大鼠残余肾模型的研究发现，8周后肾功能呈进行性恶化。有趣的是，在模型早期可能有短暂的微血管反应。尽管Kang等人认为VEGF丢失和抗血管生长因子(Thrombospondin-1，TSP-1)表达上调在该模型中发挥着一定的作用，但内皮细胞增生的具体机制尚不清楚。 胎盘生长因子(PlacentaGrowthFactor,PlGF)，是VEGF家族中的新成员。近年来发现PlGF可以结合其受体VEGFR-1(Flt-1)，传导细胞内信号，对病理性微血管发生有促进作用，但不影响其生理过程。相反，阻断VEGFR-1可以改善以微血管过渡生长为特征的疾病，如：可以抑制肿瘤、类风湿性关节炎等的血管新生。近来基因研究证明，PlGF和VEGFR-1是介导病理性血管增生的唯一关键因素。这些均表明，PlGF对微血管增生有重要意义。 PlGF在残余肾模型早期阶段微血管反应中的作用尚不清楚。因此，本研究探讨：①大鼠残余肾模型早期肾功能变化的特征；②大鼠残肾模型早期微血管病变，及其与肾功能代偿之间的相关关系；③大鼠残余肾模型早期PlGF的表达。 第一章大鼠残余肾模型早期肾功能变化的观察一、目的探讨大鼠残余肾模型早期肾功能和血压的变化规律。 二、材料和方法1.模型建立48只SD大鼠随机分成两组：假手术组和残肾模型组。24只大鼠行5/6肾切除手术：结扎右侧肾动脉并结扎左侧肾动脉三个分支中的两只。同时，24只大鼠行假手术，开腹，触其左肾，关腹。每周测体重。假手术组和残肾组在手术后第1、2、3、4周各杀六只大鼠。实验方案得到中山大学动物委员会动物实验指南的允许。 2.血压、尿素氮、肌酐的检测应用电脑自动血压心率仪(日本SoftronBP-98A)，采用尾套法，每周检测尾动脉收缩压。肌酐检测采用苦味酸法检测，由肾病实验室检测。 3.统计学分析计量资料用均数士标准差表示，组间差异比较用单因素方差(one-wayANOVA)分析，以P＜0.05视为有统计学意义。所有数据均用SPSS10.0统计学软件处理。 三、结果模型建立后，假手术组大鼠的体重随着时间进展持续上升，而残余肾模型组大鼠体重明显低于假手术组，到实验第四周时，假手术组大鼠的体重约是残肾组大鼠体重的1.3倍。 模型后第一周，残肾组大鼠的BUN、Scr和血压明显上升，但其后第2周到第4周，上述指标一直都维持在稳定水平，而不是持续性进展。假手术组大鼠的BUN、Scr和BP则无明显变化。 四、小结残余肾模型早期，大鼠肾功能和血压维持稳定，而不是持续进展，提示有代偿机制的参与。 第二章大鼠残余肾模型早期微血管病变一、目的观察大鼠残余肾模型早期微血管改变，并探讨肾功能改变和微血管反应之间的关系。 二、材料和方法1.免疫组化染色肾组织石蜡切片行免疫组化染色，内皮细胞用小鼠抗大鼠内皮细胞单克隆抗体(RECA-1)标记。残肾组和假手术组肾组织石蜡切片用RECA-1单抗和小鼠抗增生细胞核抗原(PCNA)单抗(PC10)行免疫双重免疫组织化学染色，双重染色阳性细胞(RECA-1+PCNA+细胞)为增生的内皮细胞。 2.免疫组化的量化每只动物计算至少20个高倍视野(×400)肾小球横切面(glomerularcrosssection，gcs)中毛细血管数并求得平均值，得出肾小球毛细血管指数(glomerularcapillaryindex，GCI)；计算肾皮质至少20个显微镜高倍视野(hpf)(×400)肾小管周围毛细血管指数(peritubularcapillaryindex，PCI)。同时计算至少20个肾小球横切面和至少20个高倍视野(×400)中RECA-1+PCNA+细胞(增生内皮细胞)数，并求和取平均值，得每个肾小球横切面的增生内皮细胞数的均值。 3.统计学分析计量资料用均数士标准差表示，组间差异比较用单因素方差(one-wayANOVA)分析，以P＜0.05视为有统计学意义。所有数据均用SPSS10.0统计学软件处理。 三、结果1.大鼠残余肾模型早期微血管改变与假手术组相比，残肾组平均每个肾小球横截面的RECA-1+毛细血管襻呈上升趋势，但是没有统计学意义。相反，残肾组肾小管平均周围毛细血管密度术后明显降低，直到第四周。 2.大鼠残余肾模型早期微血管增生改变残肾组肾小球毛细血管增生在模型建立后明显上调，第二周时达到高峰，平均每个肾小球横截面的RECA-1+PCNA+较假手术大鼠升高约3倍。肾小管周围内皮细胞增生也在第一周时达高峰，此后开始下降，实验结束时，肾小球和肾小管周围内皮细胞增生都回到基线水平。 四、小结1.大鼠残余肾模型早期有显著的微血管反应； 2.微血管反应出现在肾功能的稳定阶段； 3.这种微血管反应参与了延缓早期的肾脏病变进展。 第三章残肾模型早期胎盘生长因子的表达一、目的探讨大鼠残肾模型早期肾组织PlGF的表达。 二、材料和方法1.细胞培养大鼠肾小管上皮细胞、系膜细胞和巨噬细胞放入培养条件为37℃，95％空气和5％CO2的细胞培养箱。这三种细胞株，分别用DMEM(肾小管上皮细胞)和RPMI1640(系膜细胞和巨噬细胞)培养基。 2.RT-PCR肾组织提总RNA，RT-PCR检测胎盘生长因子(PlGF)mRNA的表达，以β-Actin为内参照，计算相对单位，并与假手术组比较。 3.WesternBlot取左肾组织蛋白，WesternBlot检测PlGF的表达，以β-Actin为内参照，计算与内参照比值，并与假手术组比较。 4.统计分析计量资料用均数士标准差表示，组间差异比较用单因素方差(one-wayANOVA)分析，以P＜0.05视为有统计学意义。所有数据均用SPSS10.0统计学软件处理。 三、结果1.肾组织PlGFmRNA表达RT-PCR结果显示，PlGFmRNA表达在第一周和第二周，较假手术组相比，分别上调2.8倍和2.7倍。第四周时，PlGFmRNA表达回复到基线水平。 2.肾组织PlGF蛋白表达Westernblot结果显示，假手术组仅有微量的PlGF蛋白表达。与假手术组比较，残肾组PlGF蛋白表达在第一周和第二周上调3.9和3.2倍。 3.肾细胞PlGF蛋白表达Westernblot结果显示，肾小管上皮细胞PlGF蛋白表达最强。巨噬细胞PlGF蛋白表达最弱。系膜细胞表达居于两者之间。 四、小结1.PlGF可能是大鼠残余肾模型中微血管发生的主要动力； 2.肾小管上皮细胞是PlGF的主要来源。 结论本研究首次观察到大鼠残余肾模型早期肾功能和血压处于稳定，提示残余肾模型存在肾功能代偿，发现模型早期有明显的微血管反应；同时，PlGF表达明显上调。表明，微血管反应可能延缓肾功能和血压的进展；PlGF可能对残肾模型的内皮细胞增生有促进作用。 因此，PlGF在肾脏微血管病变中有良好的前景。