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神经元限制性沉默因子(NRSF/REST)是一种锌指蛋白转录因子,它能结合于一个被称为神经限制性沉默元件(NRSE/RE1)的保守DNA片段上,从而在转录水平抑制许多和神经元发育及功能相关的基因在非神经元细胞中的表达。NRSF/REST分子量为116kD,属于类Gli-Kruppel转录因子家族,因为其能与NRSE/RE1结合而被发现。NRSF/REST包含N端阻遏结构域RD-1,近N端锌指结构,DNA结合结构域(含有七个排列成簇的C2H2锌指结构)、赖氨酸富集区、脯氨酸富集区、C端遏阻结构域RD-2(含有一个锌指结构)。实验表明,NRSF/REST在抑制神经元特异性基因在非神经元细胞中的表达,以及防止神经元前体细胞过早向神经元分化等过程中起着关键作用,NRSF/REST表达的下调是保证神经元正确分化的重要基础,也是神经元表型维持所必需的。深刻理解NRSF/REST是如何特异性识别NRSE/RE1保守DNA片段和两者之间的作用模式,是在分子水平上阐释NRSF/REST在神经发育中所起作用的坚实基础。
第一章侧重于REST识别RE1过程中起关键作用的锌指模体的表达与纯化。首先利用EMSA实验确定了ZF5,ZF6在对REST识别RE1 dsDNA和ds RNA非常关键,随后将pET15b-ZF35及pET15b-ZF57转入大肠杆菌Rosetta(DE3)中可溶表达了REST DNA结合结构域ZF35及ZF57蛋白,通过质谱,CD谱和NMR gNhsqc谱对ZF57进行表征,表明ZF57为锌离子依赖蛋白,且折叠良好。利用荧光偏振方法获得了这两种蛋白与RE1的解离常数,比较解离常数大小,进一步确证ZF57中三个连续锌指在REST识别RE1的过程中非常关键。
第二章侧重于对15N,13C双标ZF57核磁谱图的采集、信号归属。对ZF57进行了归属相关二维和三维核磁共振实验,完成了ZF57主链、侧链及NOE信号归属。
第三章侧重于结构计算和主链动力学研究。利用CALIBA软件将NOE强度转化成距离约束,利用TALOS程序获得二面角信息,CSI获得二级结构信息。将距离约束、二面角约束及氢键约束带入到Xplor-NIH软件中进行分子动力学与模拟退火运算,获得最终溶液结构。从100个最后计算结构中挑选出15个能量最优的结构代表ZF57真实溶液结构,其中主链RMSD值为0.61±0.22(A),所有重原子RMSD值为0.93±0.19(A),拉氏图中,91.3％的残基在最优区域。ZF57整体的折叠与C2H2锌指家族中所报道的其他成员类似,具有典型的C2H2模体ββα构象。在ZF57中包含3个锌指模体,第一个锌指模体中Y299、K300与S307、S308形成反平行的β-折叠片,K311-H321形成α-螺旋;第二个锌指模体中F327、K328与V335、A336形成反平行的β-折叠片,G339-V349形成α-螺旋;第三个锌指模体中L356、N357、C358与Y363、K364、T365行成反平行的β-折叠片,R368-H378形成α-螺旋。将ZF57结构与Zif268-DNA复合物结构进行对比,推测ZF5在结合DNA后构象发生翻转,ZF57主链动力学实验也证实ZF5比ZF6,ZF7活动性更强。
第四章侧重于对ZF57及ZF58M与RE1的识别模式进行研究。首先利用荧光实验找到ZF57识别的核心序列为BK,NMR化学位移扰动实验表明ZF5,ZF6与DNA绪合,ZF7与DNA不发生接触。解析ZF57与BK复合物溶液结构,证明以上推断都是正确的。为了研究ZF7的功能,表达纯化了ZF57L3及ZF58M,荧光偏振实验推测ZF58M与RE1的结合模式:ZF5识别RE1的AGC(第16,17,18位),ZF6识别RE1的GAC(第13,14,15位),ZF8M识别RE1的ACC(第7,8,9位),在ZF8M,Linker3,ZF6,ZF5的协同作用下,ZF7与DNA被动接近,与RE1的ATG(第10,11,12位)靠拢,但无相互作用。结合模式合理解释了RE1序列中第10,11位碱基的不保守性,ZF57,ZF57L3,ZF58M与突变RE1的荧光偏振实验也证明了第11位碱基不与蛋白作用。ZF35,ZF57与RE1的结合能力的巨大差异说明ZF3,ZF4与RE1结合能力不强,故对ZF3,ZF4,ZF7的突变不会影响REST对RE1的特异性识别。将ZF6进行突变,在REST的DNA结合结构域中就会形成不与RE1相互作用的大约60aa的连续片段,REST不能有效结合RE1,功能丧失。突变ZF5后,由于ZF7自身不结合RE1,ZF5突变后同样也丧失结合功能,ZF6N端,C端的协同作用使ZF6与RE1的结合能力被大大削弱,所以突变ZF5后REST与RE1的结合能力同样丧失,与第一章EMSA实验结果一致。