论文部分内容阅读
目的:克隆人干扰素调节因子3(Interferon regulatory factor 3,IRF-3)基因启动子并寻找其核心功能区域,鉴定与IRF-3基因启动子结合的转录因子,为阐明其表达调控机制奠定基础。方法:以HEK 293细胞基因组DNA为模板,采用PCR方法获取IRF-3基因5’侧翼序列,测序正确后插入pGL3-Basic载体。运用双荧光素酶报告基因检测系统鉴定其启动子活性。采用缺失分析法分别从IRF-3基因5’侧翼的5’端逐段缺失,克隆得到不同长度的截短片段,插入pGL3-Basic载体,使用双荧光素酶检测系统定位IRF-3基因启动子核心功能区域,鉴定其启动子活性。利用点突变技术、凝胶迁移实验(EMSA)、染色质免疫沉淀(ChIP)、RNA干扰和基因过表达等实验,分析IRF-3启动子区的转录因子结合位点。结果:克隆到的IRF-3基因5’侧翼序列与Genbank中记录完全一致,荧光素酶活性分析结果显示其在HEK 293细胞中具有明显的启动子活性。自5’端缺失的截短片段其活性表现为先升高后降低,-149～+18 bp截短片段表现出接近最高的启动子活性,而-93～+18 bp截短片段的活性基本消失,提示IRF-3的核心启动子区域位于-149～-93 bp之间。生物信息学预测该区域包含了Sp1/3、E2F、CEBP-α和GATA-1等结合位点,点突变结果表明Sp1/3和E2F位点维持了IRF-3的基本转录活性。EMSA和ChIP实验结果表明Sp1、Sp3和E2F1转录因子与IRF-3的启动子区有结合。RNA干扰和基因过表达实验表明Sp1和Sp3增强了IRF-3的启动子活性,E2F1抑制了IRF-3的启动子活性。结论:人IRF-3基因的核心启动子区域位于转录起始位点上游-149至-93 bp处,在核心启动子调控方面,Sp1、Sp3和E2F1起关键调控作用,Sp1和Sp3正调控,E2F1负调控。