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背景:糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病重要的并发症,并且是全球终末期肾病(End-stage renal disease,ESRD)的首要病因,研究DN的机制和治疗策略对提高患者的生活质量具有重要的意义。肾小管损伤是DN发生发展中的关键一环,也是DN肾小管间质纤维化进行性进展的病理学基础,因此,探索肾小管损伤机制在DN发病机制的研究中占重要地位,对确定早期干预靶点,改善DN远期预后具有重要的临床意义。脂氧化酶(Lipoxygenase,LO)是将氧分子插入花生四烯酸和亚油酸等多不饱和脂肪酸的酶家族,根据插入花生四烯酸中氧位置的不同分为5-,8-,12-和15-LO。12-LO与DN的发病机制密切相关。研究表明葡萄糖刺激的肾小球系膜细胞(Mesangial cells,MCs)和DN动物模型中12-LO m RNA和蛋白质水平增加。12-LO及其下游产物12(S)-HETE可以直接激活p38MAPK,诱导细胞肥大和细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)中的纤维粘连蛋白(Fibronectin,FN)的表达。LO激活可以通过产生超氧化物直接导致氧化应激,介导DN细胞损伤。当前12-LO与DN相关的研究主要集中在12-LO对肾小球的损伤机制,而12-LO对DN肾小管的影响及其作用机制至今尚不清楚。肾胺酶(Renalase,RNLS)是一种主要由肾小管上皮细胞产生和分泌的胺氧化酶。它可降解循环中的儿茶酚胺并调节心脏功能和血压。急慢性肾小管损伤时,RNLS在肾组织内的表达显著下降。最新研究表明RNLS除了酶活性以外,还有类细胞因子作用。外源性RNLS通过减少被激活的ERK磷酸化水平,改善单侧输尿管梗阻(Unilateral ureteral obstruction,UUO)诱导的慢性肾脏病(Chronic kidney disease,CKD)模型小鼠的肾小管间质纤维化。另外一项研究发现RNLS及其去酶活性亚型RP200通过迅速抑制p38MAPK的磷酸化,同时抑制JNK来减缓顺铂或过氧化氢诱导的人近端肾小管上皮细胞的毒性损伤。然而,RNLS在DN肾小管的表达变化,对DN肾小管损伤的影响以及作用机制仍需进一步探讨。诸多研究表明肾脏p38MAPK活性增加与DN的进展有关。在糖尿病动物模型中,高血糖刺激下肾小球和肾小管中p38MAPK活性迅速增加。最新研究发现p38MAPK激活与糖尿病肾小管肥大和间质纤维化有关,而且p38MAPK主要在肾小管上皮细胞中表达增加。p38MAPK活化诱导大鼠肾小管细胞中产生血管紧张素原,刺激转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)诱导FN在肾间质成纤维细胞中的积累,增加肾小管细胞中TGF-β的表达。同时,p38MAPK磷酸化诱导肾小管内凋亡标志物caspase-3增加。这些研究结果提示p38MAPK及其下游的信号通路的激活是DN肾小管损伤的重要机制之一。综上,本研究提出假设:12-LO在DN肾小管中表达升高,同时下调DN肾小管内RNLS的表达,进而通过激活p38MAPK信号通路,加重肾小管上皮细胞损伤和凋亡。方法:(1)将大鼠肾小管上皮细胞分为2组:正常对照组(CON),高糖刺激组(HG),分别于24h,48h后收集细胞,western blot检测RNLS、BCL-2、BAX、caspase-3水平。(2)将大鼠肾小管上皮细胞分为2组:正常对照组(CON),高糖刺激组(HG),分别于24h,48h后收集细胞,western blot检测RNLS、p38MAPK、p-p38MAPK、ERK、p-ERK水平。(3)将大鼠肾小管上皮细胞分为3组:正常对照组(CON),高糖刺激组(HG),细胞内过表达肾胺酶加高糖刺激组(RNLS+HG),48h后收集细胞,western blot检测RNLS、BCL-2、BAX、caspase-3、p38MAPK、p-p38MAPK水平。(4)采用大剂量链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)(65 mg/kg,腹腔注射)诱导1型糖尿病大鼠模型,以空腹血糖>16.7mmol/L为1型DM造模成功标准,以24 h尿白蛋白升高说明本实验模型大鼠符合DN特征。1型糖尿病模型成功后随机分为2组:1型糖尿病肾病组(DN)和CDC(Cinnamyl-3,4-dihydroxy-α-cynanocinnamate,12-LO抑制剂,腿部皮下注射,8 mg/kg/d,3次/周)治疗组(DN+CDC)。以规律正常饮食大鼠作为对照组(CON)。8周后处死大鼠,提取大鼠肾脏。实验期间连续监测大鼠空腹血糖,收集24h尿液。为了评估肾小球及足细胞的损伤,用定量逆转录聚合酶链反应(Quantitative reverse transcription PCR,RT-q PCR)检测了足细胞标志性蛋白Podocin和Nephrin表达水平。(5)为证明12-LO参与DN肾小管损伤,以及肾小管上皮细胞的凋亡,提取以上3组的大鼠肾脏组织,过碘酸-希夫氏(Periodic acid schiff,PAS)染色观察肾小球及肾小管损伤,脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(Td T-mediated d UTP Nick-End Labeling,TUNEL)染色观察肾小管上皮细胞凋亡情况,Masson染色观察肾小管间质纤维化的情况,免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)观察肾小管组织12-LO表达水平,同时RT-q PCR检测12-LO、BAX、BCL-2的m RNA表达,蛋白印迹法(Western blot)检测12-LO、p-p38MAPK、BAX、BCL-2,caspase-3蛋白水平。(6)在以上实验基础上,为证明12-LO变化引起RNLS变化,进而加重肾小管上皮细胞损伤,提取以上3组大鼠的肾脏组织,IHC观察肾小管组织RNLS表达水平,同时用RT-q PCR和western blot检测各组RNLS m RNA和蛋白表达。(7)在以上实验基础上,为进一步证明RNLS通过p38MAPK通路减轻肾小管上皮细胞损伤,提取以上3组大鼠的肾脏组织,IHC观察肾小管组织p-p38MAPK表达水平,western blot检测各组p-p38MAPK蛋白水平。采用酶联免疫吸附检测法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测尿白蛋白水平,western blot、RT-q PCR检测相关蛋白和m RNA表达,IHC观察肾小管组织12-LO,RNLS、p38MAPK表达情况,PAS染色观察肾小球及肾小管损伤,Masson染色观察肾小管间质纤维化的情况,TUNEL染色观察肾小管上皮细胞凋亡情况。结果:(1)与对照组相比,DN组大鼠血糖、肾重/体重及24 h尿白蛋白均明显增加(P<0.05),足细胞标志性蛋白Podocin和Nephrin表达水平明显增加(P<0.05)肾小球体积明显增大,符合典型DN改变。(2)DN组大鼠肾组织内12-LO转录和蛋白表达水平较对照组显著升高(P<0.05)。IHC染色也显示:与对照组相比,DN组大鼠肾小管内12-LO表达明显增多。PAS染色观察到对照组肾小球、肾小管结构正常,毛细血管清晰,而DN组肾小管管腔狭窄,肾小管肿胀、部分萎缩,上皮细胞数量减少;Masson染色显示,与对照组相比,DN组大鼠肾小管管腔狭窄,肾小管上皮细胞萎缩,间质胶原纤维明显增多。(3)CDC主要抑制12-LO的酶活性,DN+CDC组肾组织12-LO蛋白水平与DN组无明显差异。IHC染色也显示:DN+CDC组肾小管12-LO表达水平与DN组无明显差异。PAS染色和Masson染色所示,与DN组相比,DN+CDC组肾小管狭窄、肿胀、萎缩等病变明显减轻,间质渗出和胶原纤维显著减少。(4)DN组大鼠肾组织内RNLS表达较对照组明显减少(P<0.05)。IHC染色所示,DN组肾小管内RNLS蛋白水平较对照组明显减少。高糖刺激大鼠肾小管上皮细胞后24小时可见RNLS蛋白表达呈下降趋势,维持48小时后,RNLS蛋白水平较对照组显著下降(P<0.05)。(5)DN组肾组织内减少表达的RNLS,在DN+CDC组呈显著升高(P<0.05)。DN组肾组织内下降的RNLS转录水平,在DN+CDC组呈显著上调(P<0.05)。IHC染色显示,DN组肾小管内12-LO水平明显升高,RNLS呈低表达,而给予CDC 8周后的DN+CDC组肾小管内RNLS蛋白水平显著升高。(6)DN组p38磷酸化产物p-p38MAPK蛋白水平较对照组显著升高(P<0.05),给予12-LO抑制剂CDC 8周后的DN+CDC组肾组织内上调的p-p38MAPK较DN组明显减少(P<0.05)。ERK信号通路的磷酸化水平在DN组和DN+CDC组均无明显变化。IHC染色显示DN组大鼠肾小管内p-p38MAPK蛋白水平明显升高,显著上调的p-p38MAPK在DN+CDC组明显减少,而p-ERK蛋白水平在对照组、DN组和DN+CDC组3组间无明显差异。(7)DN组大鼠肾组织内细胞凋亡相关蛋白BAX和Cleaved Caspase-3表达较对照组显著升高(P<0.05),抗细胞凋亡蛋白BCL-2表达下降(P<0.05),而DN+CDC组升高的BAX和Cleaved Caspase-3明显减少,BCL-2表达呈回升,差异均较DN组有显著性差异(P<0.05)。BAX/BCL-2转录比值得出DN组大鼠肾组织内BAX/BCL-2转录比值较对照组明显升高(P<0.05),而DN+CDC组较DN组显著下降(P<0.05)。TUNEL染色显示DN组大鼠肾小管内棕黄色核染色数目较对照组明显增多,而DN大鼠给与CDC 8周后的DN+CDC组肾小管内棕黄色核染色数目较DN组明显减少。(8)HG刺激下RNLS蛋白水平较对照组显著下降(P<0.05),同时p-p38MAPK水平明显升高(P<0.05),而p-ERK蛋白水平与对照组无显著性差异。DN组大鼠肾小管上皮细胞内凋亡相关蛋白BAX和Cleaved Caspase-3表达较对照组显著升高,抗细胞凋亡蛋白BCL-2表达减少,均较对照组有显著性差异(P<0.05)。(9)DN状态诱导的RNLS低表达伴随的p-p38MAPK、凋亡相关蛋白BAX和Cleaved Caspase-3水平的升高,在RNLS高表达+HG刺激组均呈显著减少(P<0.05)。在HG组下调表达的抗细胞凋亡蛋白BCL-2,在RNLS高表达+HG刺激组呈显著升高(P<0.05)。结论:(1)12-LO参与DN肾小管损伤,DN肾小管内上调表达的12-LO与肾小管损伤和细胞凋亡密切相关。(2)12-LO降低DN肾小管内RNLS蛋白水平,抑制12-LO活性可逆转RNLS低表达。(3)RNLS/p38MAPK信号通路参与12-LO调控DN肾小管损伤和细胞凋亡。