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幽门螺杆菌(Helicopter pylori,Hp)是人体内最常见的病原微生物之一,其感染率约占世界人口的50%。目前我国约有7亿人已感染Hp,未感染人群也普遍易感。流行病学研究提示Hp与胃癌的发生关系密切,世界卫生组织(WHO)已把Hp列为胃癌的首要致病因子。Hp感染引起的胃上皮细胞凋亡异常在胃癌的发生发展中起主要作用,但是其具体机制尚不清楚。Hp空泡细胞毒素(Vacuolating cytotoxin,VacA)与Hp产生的其它已知细菌毒素无明显的同源性,因其可致真核上皮细胞发生空泡变性而得名,是目前倍受关注的细胞毒力因子之一。胃癌患者所感染的Hp大多含有VacA,推测其在胃癌发生过程中可能起着较为重要的作用。VacA作为Hp的主要毒力因子,诱导上皮细胞凋亡是引发细胞癌变的关键分子,VacA诱导凋亡的作用与致空泡的作用虽有关联但不互为因果,但均与其膜通道活性改变有关。进一步研究发现VacA进入上皮细胞,能够靶向线粒体,引起线粒体膜通透性发生转换(mitochondrial permeability transition,MPT),造成线粒体跨膜电位降低、细胞色素c释放、活化凋亡相关因子等一系列变化,诱导细胞发生凋亡, VacA导致MPT的机理尚不明确。腺嘌呤核苷酸转移酶(adenine nucleotide translocase,ANT)是线粒体内膜上含量最丰富的蛋白。它是将细胞的产能和耗能过程耦联起来的主要载体,也是组成线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP,或简称PT孔)的关键组分,参与调节线粒体膜通透性转换孔的开放,与细胞凋亡紧密相关。线粒体凋亡途径是细胞的内源性凋亡途径,线粒体凋亡的发生最终都归结于MPT,而MPT的发生又是由于PT孔的开放所致。PT孔的分子构成尚不完全清楚,但目前已明确ANT是其位于线粒体内膜的关键蛋白,它在线粒体内、外膜的交接点处可形成“非特异性孔道”,通过它的开放、关闭以及与一些凋亡调控因子(如Bax/bcl-2家族)的互动,参与组织细胞凋亡的调控。VacA可以迅速转运至线粒体内膜,其导致的线粒体内膜通透性转换明显早于外膜通透性转换。其它配体或蛋白质可与ANT发生相互作用改变其构象来控制PT孔的开放与关闭,通过调节膜通透性的改变来达到调控细胞凋亡的目的,ANT在MPT中处于核心地位。研究VacA与ANT的相互作用关系,将有助于进一步明确VacA致MPT的机理。本研究通过酵母双杂交和免疫共沉淀来探索VacA与ANT的相互作用关系,为阐明Hp通过线粒体凋亡途径诱发胃癌的分子机制提供科学依据。1.酵母双杂交诱饵质粒的构建及鉴定提取幽门螺杆菌标准毒株NCTC11637基因组DNA,PCR扩增VacA片段,并将其克隆入pGBKT7载体构建pGBKT7-VacA诱饵质粒。通过酶切和测序鉴定诱饵质粒构建成功后,将诱饵质粒转化宿主酵母菌AH109后,提取酵母总蛋白,Western-Blot分析重组蛋白的活性。同时分别检测了诱饵质粒的毒性、渗漏和自激活活性。结果显示构建的诱饵质粒对酵母菌无毒性、无渗漏也未表现自激活活性。2.酵母双杂交猎物质粒的构建及鉴定RT-PCR扩增ANT各异构体——ANT1、ANT2、ANT3基因,并分别将它们克隆入pGADT7载体构建pGADT7-ANT1、pGADT7-ANT2、pGADT7-ANT3猎物质粒,进行酶切和测序鉴定。各猎物质粒分别转化宿主酵母菌Y187后,提取酵母总蛋白,Western-Blot分析各重组蛋白的活性。一系列活性和毒性检测结果表明全部质粒均具有天然活性、对宿主未表现毒性,并且无渗漏和自激活活性。3.酵母双杂交试验将转化了诱饵质粒pGBKT7-VacA的酵母菌AH109分别与转化了猎物质粒pGADT7-ANT1、pGADT7-ANT2、pGADT7-ANT3的酵母菌Y187两两配对交配培养,富集交配后的合子铺不同严谨程度营养缺陷培养基,X-α-Gal检测报告基因的激活,结果未检测到报告基因的转录,表明VacA与ANT在酵母双杂交系统内未发生相互作用。4.VacA免疫共沉淀载体的构建及鉴定以pGBKT-VacA质粒DNA为模板,PCR扩增得到VacA片段并将其克隆入pCMV-Myc载体中构建pCMV-Myc-VacA表达质粒。将构建好的质粒采用脂质体法瞬时转染AGS细胞,Western Blot检测重组质粒在AGS细胞内的表达,结果表明重组蛋白得到正确表达。5.ANT各异构体免疫共沉淀载体的构建及鉴定分别以pGADT7-ANT1、pGADT7-ANT2、pGADT7-ANT3质粒DNA为模板,PCR扩增ANT1、ANT2、ANT3基因片段,并将其分别克隆入pCMV-HA载体中构建pCMV-HA-ANT1、pCMV-HA-ANT2、pCMV-HA-ANT3融合表达质粒。将构建好的各质粒采用脂质体法分别瞬时转染AGS细胞,Western Blot检测各重组质粒在AGS细胞内的表达,结果表明各重组蛋白均得到正确表达。6 .免疫共沉淀试验将pCMV-Myc-VacA载体分别与pCMV-HA-ANT1、pCMV-HA-ANT2、pCMV-HA-ANT3载体配比瞬时共转染AGS细胞,提取细胞总蛋白进行免疫共沉淀试验,分别用VacA抗体沉淀ANT(ANT1、ANT2、ANT3)和ANT抗体沉淀VacA,验证二者在细胞内的蛋白相互作用。结果表明VacA与ANT之间不能发生免疫共沉淀反应。