杆状病毒是一类有包膜的、大型双链DNA病毒,它的宿主主要是节肢动物（特别是昆虫）,而且在环境中普遍存在。研究最多的杆状病毒是苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）。杆状病毒被称为安全的生物杀虫剂,但因其杀虫谱窄,杀虫效率过低使它的应用极其受限。研究者通常利用基因工程的方法来增强杆状病毒的活性,提高其杀虫效率。AcMNPV orf 25编码一个含316个氨基酸残基的蛋白,该蛋白与BmNPV DNA结合蛋白DBP的同源性较高,推测Ac25是一种潜在的DNA结合蛋白,可能参与DNA复制的过程。有研究表明ac25是一个必需基因,缺乏ac25的病毒会产生有缺陷的核衣壳。Ac25不是病毒粒子结构蛋白,它是一种病毒发生基质的组分,敲除ac25基因的杆粒不会产生正常的病毒发生基质。为了明确和揭示Ac25在AcMNPV侵染宿主Sf9细胞过程中的作用机制,本研究开展了Ac25的功能分析。本研究主要分为三部分:第一部分:重组病毒vAc^ac25KO-EGFP、vAc^ac25KO-Ac25-EGFP、vAc-Ac25-EGFP的构建及Ac25-EGFP的表达分析我们首先利用λ-Red同源重组和Bac-to-Bac表达系统构建了ac25敲除型病毒vAc^ac25KO-EGFP,侵染Sf9细胞后发现几乎没有绿色荧光产生,表明敲除ac25以后可抑制子代病毒的增殖。为了验证这一现象是由于ac25的缺失所造成的,我们构建了ac25回补型病毒vAc^ac25KO-Ac25-EGFP,观察到一、二、三代病毒侵染细胞后所对应的绿色荧光逐渐增多,说明回补ac25后子代病毒的增殖能力得到了恢复,进而明确了ac25对子代病毒的产生是至关重要的。进一步,我们构建了过表达病毒vAc-Ac25-EGFP并测定各重组子代病毒的滴度,用5 MOI的vAc^ac25KO-Ac25-EGFP和vAc-Ac25-EGFP分别侵染Sf9细胞,Western blot结果显示,在vAc^ac25KO-Ac25-EGFP和vAc-Ac25-EGFP处理组中,Ac25-EGFP在24 h p.i.开始表达,且表达量从24-72 h p.i.均持续增加。vAc-Ac25-EGFP处理组中Ac25-EGFP的表达量在24、48、60和72h p.i.要显著高于vAc^ac25KO-Ac25-EGFP处理组。第二部分:Ac25在AcMNPV侵染宿主细胞过程中的功能分析首先通过TCID₅₀终点稀释法检测了vAc^ac25KO-EGFP、vAc^ac25KO-Ac25-EGFP和vAc-Ac25-EGFP的子代病毒增殖情况。结果显示,敲除了ac25后基本上没有子代病毒的产生,回补型病毒vAc^ac25KO-Ac25-EGFP与vAc-EGFP的子代病毒产量基本一致,而过表达ac25后BV的产量要显著性地高于vAc-EGFP处理组,表明ac25对子代病毒的产生是必须的,而且过表达ac25能够促进子代病毒的增殖。接着,用5 MOI的vAc-Ac25-EGFP和vAc-EGFP分别侵染Sf9细胞24-96 h,通过绝对定量PCR检测了病毒基因组DNA的复制水平。结果显示,用vAc-Ac25-EGFP处理细胞后,细胞内病毒基因组的拷贝数从24-96 h p.i.逐渐增加。vAc-EGFP处理组中,病毒基因组的拷贝数也是呈上升趋势,但是总体水平略低于过表达病毒处理组,表明过表达Ac25能够促进病毒基因组的复制。通过qPCR检测了感染细胞中病毒晚期基因38k和vp39的转录水平,表明vAc-Ac25-EGFP处理组中38k和vp39的转录水平均显著高于vAc-EGFP对照组,说明过表达Ac25能够促进38k和vp39基因的转录。最后,通过MTT实验检测了vAc-Ac25-EGFP和vAc-EGFP对Sf9细胞增殖的影响,结果表明过表达Ac25能够抑制Sf9细胞的增殖。第三部分:Ac25的核定位信号序列的功能分析前两章我们明确了Ac25在AcMNPV侵染宿主细胞过程中的重要性,证明了它对子代病毒的产生是必需的。Ac25主要定位在细胞核,本章我们预测到Ac25蛋白的19-23位氨基酸残基是一个典型的核定位信号序列,为了研究此序列对Ac25蛋白进核的作用,我们构建了突变型病毒vAc^ac25KO-Ac25^{PKRER19-23AAAAA}-EGFP以及过表达突变型病毒vAc-Ac25^{PKRER19-23AAAAA}-EGFP。首先通过TCID₅₀实验检测了这两种突变型重组病毒的子代病毒增殖情况。相较于vAc-EGFP,vAc^ac25KO-Ac25^{PKRER19-23AAAAA}-EGFP抑制了子代病毒的增殖,vAc-Ac25^{PKRER19-23AAAAA}-EGFP所产生的子代病毒数量也显著低于过表达病毒vAc-Ac25-EGFP处理组。接着,用5MOI的vAc^ac25KO-Ac25-EGFP、vAc^ac25KO-Ac25^{PKRER19-23AAAAA}-EGFP、vAc-Ac25-EGFP和vAc-Ac25^{PKRER19-23AAAAA}-EGFP分别侵染Sf9细胞24-96 h。Western blot结果显示,vAc^ac25KO-Ac25^{PKRER19-23AAAAA}-EGFP处理组中Ac25-EGFP在细胞核内的积累丰度显著低于vAc^ac25KO-Ac25-EGFP处理组。同样,vAc-Ac25^{PKRER19-23AAAAA}-EGFP处理组中Ac25-EGFP在细胞核内的积累量显著低于vAc-Ac25-EGFP处理组。因此,突变Ac25的核定位信号序列后,使得Ac25-EGFP在感染细胞的细胞核中聚集减少,进而导致子代病毒的产量降低,表明此核定位信号序列对于Ac25进入细胞核发挥着重要的作用。本研究揭示了Ac25在AcMNPV侵染宿主细胞过程中的功能,它依赖其核定位信号在细胞核中高度积累,促进病毒DNA的复制以及晚期基因的表达,进而刺激子代病毒的产生。以上结果进一步完善了AcMNPV基因组功能的注释,为解析AcMNPV对宿主细胞的作用机制提供理论依据。