五种病害相关植原体的分子鉴定

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本论文利用分子生物学手段对棣棠丛枝病、凤仙花绿瓣病、迎春丛枝病、黄刺梅丛枝病、小叶女贞从枝病病原进行分子检测与鉴定。   用植原体16S rRNA基因和tuf基因通用引物,对表现丛枝症状的棣棠DNA进行巢式PCR扩增,分别得到了约1.2kb和800bp的特异性片段。序列分析表明:与棣棠丛枝相关植原体(KWB)的16SrRNA基因和tuf基因均与翠菊黄化植原体组(16SrI)D亚组泡桐丛枝株系一致率最高,为99.4%和99.6%。在系统进化树中,KWB也与16SrI-D亚组分离物聚类到一起。利用虚拟RFLP分析发现,KWB的16S rRNA基因AluⅠ、HhaⅠ、MseⅠ、TaqⅠ限制性酶切图谱与16SrI-D业组植原体一致。以上结果表明,与棣棠丛枝病相关的植原体属于16SrI-D亚组。   利用植原体16S rRNA和核糖体蛋白基因(rp)通用引物从表现绿瓣症状的凤仙花DNA中分别扩增得到了约1.24kb和1.21kb的特异性片段。序列测定和分析的结果表明,与凤仙化绿瓣病(Balsamine virescence,BV)相关植原体的16S rRNA基因和rp基因均与翠菊黄化植原体组(16SrI)泡桐丛枝株系(16SrI-D亚组)一致率最高,为99.7%。在系统进化树中,BV也与16SrI-D亚组分离物聚类到一起。利用虚拟RFLP分析发现,BV限制性酶切图谱与16SrI-D亚组植原体一致。本研究首次从分子水平上证明与凤仙花绿瓣病相关的植原体属于16SrI-D亚组。   对表脱丛枝症状的迎春枝条的韧皮部进行超薄切片及电镜观察,发现大量典型植原体。通过对16S rRNA基因和rp基因序列分析发现,与迎春丛枝相关植原体(JNWB)的16S rRNA基因和rp基因均与翠菊黄化植原体组(16SrI)D亚组泡桐丛枝株系一致率最高,为99.6%和99.7%。在系统进化树中,JNWB也与16SrI-D亚组分离物聚类到一起。利用虚拟RFLP分析发现,JNWB的16SrRNA基因17种限制性酶切图谱与16SrI-D业组植原体一致。以上结果表明,JNWB属于16SrI-D亚组。与迎春丛枝病相关的植原体属于16SrI-D亚组。   以表现丛枝症状的黄刺梅枝条总DNA为模板进行巢式PCR扩增,得到了约1.24kb的16S rRNA基因片段、800bp的tuf基因片段和1.21kb的rp基因片段,将此植原体命名为黄刺梅丛枝植原体(Rosa xanthina wiches’-broom phytoplasma,RXWB)。对获得的序列与NCBI数据库中相关植原体序列进行一致率分析,发现与翠菊黄化组(16SrI组)植原体一致率较高,其中与16SrI-D组的一致率分别高达99.8%、99.9%、99.8%。在系统进化树中.RXWB与16SrI-D亚组中的植原体聚为一簇。利用iphyClassifier在线软件模拟RFLP分析,发现RXWB与16SrI-D亚组FJ263621的酶切图谱一致。所有证据表明RXWB属于16SrI-D亚组。   从表现丛枝等症状的小叶女贞的总DNA中,克隆了其16S rRNA基因、tuf基因,与16SrI-D组序列的一致率分别高达99.8%和99.7%。系统进化分析中,PPWB与16SrI-D亚组中的植原体聚为一簇。基于16S rRNA基因的模拟RFLP分析也表明PPWB与16SrI-D亚组植原体酶切图谱一致。结果证明,自然表现丛枝症状的小叶女贞枝条中存在16SrI-D亚组的植原体。
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