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在脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)常导致严重的神经功能障碍，传统疗法收效甚微。既往认为中枢神经系统(central nervous system, CNS)不具有修复能力，一旦受损就无法修复。但伴随着神经干/祖细胞(neural stem/progenitor cells, NSPCs)的发现，不断有研究发现CNS不但可以由NSPCs进行替代修复，并且NSPCs广泛分布于CNS的诸多部位，如嗅球、海马、室管膜下区等。NSPCs具有自我更新能力并可分化为神经元和神经胶质细胞，这些特性都使其成为修复脊髓损伤的治疗热点。但许多实验发现单独使用NSPCs治疗脊髓损伤疗效差强人意，绝大多数单独移植的NSPCs都在2周后凋亡、消失。导致这种现象的原因被认为是受损脊髓局部存在过强的抑制性因素，而促进NSPCs存活的有益因素又很缺乏。树突状细胞(dendritic cells, DCs)是已知抗原提呈能力最强的抗原提呈细胞(antigen-presenting cell, APC)，其负责调控免疫应答过程，并且DCs自身又能分泌多种细胞因子参与局部微环境的调控。本课题组以及Mikami等证实受损脊髓移植树突状细胞能够改善局部微环境，促进内源性神经干细胞增殖，进而促进脊髓功能恢复。但DCs是通过何种机制促进脊髓损伤修复的，现尚存争议。对比巨噬细胞、T淋巴细胞，DCs分泌NT-3的量远高于其他几种常见的用于治疗脊髓损伤的免疫细胞。且本实验组前期体外实验发现，NSPCs与DCs共培养上清液中的NT-3浓度较对照组明显升高，并在48h达到峰值浓度。神经营养因子-3(neurotrophin-3, NT-3)属于神经营养因子家族，其具有能够支持神经元存活，促进其生长、分化，维持其功能，神经元受损时可以保护其存活和促进其再生能力。升高的NT-3能促进NSPCs增殖，并更好的向神经元方向分化。NT-3的生物学效应主要是通过其特异性酪氨酸激酶受体C(tyrosine kinase receptor C, TrkC)进行传递的。根据上述现象，我们推测移植DCs能辅助移植的NSPCs存活。这种生物学效应是由其分泌的NT-3产生的。本实验采用：体内联合移植DCs和NSPCs，观察DCs对局部组织NT-3浓度调节，及其对移植的NSPCs存活的影响。同时在体外，将NSPCs和DCs使用transwell小室共培养，在特异性NT-3功能性抗体阻断NT-3/TrkC等实验因素作用下观察各组NSPCs存活情况和NT-3/TrkC信号通路激活状态，初步探讨DCs与NSPCs相互作用的机制。旨在阐明移植DCs通过何种途径对NSPCs存活进行影响进而产生修复脊髓的能力。材料与方法1．未成熟DCs的制备骨髓源性未成熟DCs制备方法参照Hauben法。方法简介：取4-6周雌性SD大鼠股骨和胫骨的骨髓组织，吹打消化成单细胞悬液，加入GM-CSF、IL-4细胞因子诱导培养，第2、4、6天换液，第7天收集细胞备用。2．新生SD大鼠全脑神经干细胞的制备及其干性鉴定原代培养的NSPCs来自1-3天普通SD大鼠或绿色荧光蛋白转基因大鼠全脑组织，详细方法参照Laura法。第7天收集神经球。胰酶消化传代。取传3代细胞加入血清刺激后进行免疫荧光检测其分化标志物，观察NSPCs干性。3．制作大鼠急性脊髓损伤模型。Basso法制作急性脊髓钝挫伤模型，造成T9到T10节段中度挫伤。9天后，将大鼠固定于立体定位上，微量注射器吸取含有细胞总量为DCs1×106、NSPCs2×104的细胞悬液5ul，缓慢注入损伤区，深度1.5mm。4．免疫组织化学染色法观察移植区NT-3改变组织、细胞团悬液或细胞爬片经多聚甲醛固定，一抗4℃过夜，二抗37℃2小时，复染细胞核。中性树脂封片，激光共聚焦显微镜检测。5．DCs和NSPCs用transwell小室共培养。使用6孔培养板利用transwell小室分隔培养DCs和NSPCs。①NSPCs/DCs组：NSPCs和DCs用Transwell小室(0.4μm, Millipore)分隔培养组，上室DCs(细胞浓度1×105/ml，1.5ml)，下室NSPCs(细胞浓度1×106/ml，2.5ml)。②DCs单独培养组：将收集的DCs加入上室(细胞浓度1×105/ml，1.5ml)，下室DMEM/F12培养基，2.5ml。③单纯NSPCs组：上室DMEM/F12，1.5ml，下室NSPCs,1×106/ml，2.5ml。④NSPCs/DCs+NT-3抗体组：细胞浓度同NSPCs/DCs组，培养基为含20μg/ml NT-3抗体的DMEM/F12。共培养48h后收集待检细胞。6．AnnexinⅤ法分析体外联合培养NSPCs的存活状态。使用商品化AnnexinV试剂盒检测NSPCs凋亡率。方法简介如下：取总数为1×106的NSPCs，加入胰酶吹打成单细胞悬液，用4℃无菌PBS清洗2次，结合缓冲液重悬，将细胞浓度调至5×105/ml。取195μl细胞悬液，先加5μl Annexin Ⅴ-FITC5min，后加入10μl浓度为20μg/ml的PI，室温孵育10min，流式细胞术检测。7．Western blot检测共培养神经干细胞球表面TrkC蛋白表达收集各组下室NSPCs细胞，经细胞裂解液裂解后提取总蛋白。其中检测磷酸化TrkC(p-TrkC)组的蛋白经磷酸化蛋白富集柱富集磷酸化蛋白，备用。将两组蛋白经考马斯亮蓝比色法定量。待检测p-TrkC的蛋白经过SDS-PAGE凝胶电泳，PVDF转膜，脱脂奶粉室温封闭2h；加入一抗：绵羊抗大鼠p-Trk C多抗，4℃过夜，二抗为辣根过氧化物酶标记兔抗绵羊抗体。待检测TrkC的蛋白经过10%SDS-PAGE凝胶电泳，PVDF转膜，脱脂奶粉室温封闭2h；加入一抗：兔抗TrkC多抗，4℃过夜，二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗兔抗体。曝光、显影、定影。数码成像分析系统进行结果分析。8．qRT-PCR检测共培养神经干细胞NT-3，TrkC mRNA表达所有设计引物合成自上海生工生物工程有限公司设计并合成(表1)。参照Trizol试剂盒说明提取中RNA。逆转录反应体系：SYBR Premix Ex TaqTM(2×)6.8μl、上下游primer (10μM)1.6μl、cDNA模版1.6μl、dH2O6.8μl。反应条件：95℃预变性90s、52.6℃退火30s、68℃延伸60s45个循环、68℃5min。产物经凝胶电泳后，读取条带灰度值，以目的条带与内参条带的比值代表目的基因mRNA的表达水平。9．统计分析数据以mean±SD表示，采用SPSS13.0软件进行统计学处理。两组间均数比较采用t检验，设定p<0.05为有显著性差异。结果1.DCs与NSPCs共移植能促进NSPCs在体内的存活。局部联合移植DCs与NSPCs两周后，每400倍视野下NSPCs存活量：DCs+NSPCs组(57.33±5.13)较NSPCs组(33.33±6.11)明显增加，结果有统计学差异(p<0.05)。2.与DCs体外共培养能明显促进NSPCs存活。流式细胞学检测发现DCs+NSPCs组Annexin V-PI-性细胞占总细胞的DCs+NSPCs组(48.83%±1.65%)，较NSPCs组(37.80%±1.96%)、NSPCs/DCs+NT-3抗体(37.77%±2.73%)组显著性增高。且NSPCs/DCs组AnnexinV+PI-的早期凋亡细胞(19.45%±0.94%)较NSPCs组(25.30%±1.63%)、NSPCs/DCs+NT-3抗体组(34.14%±3.62%)明显降低。3.体外共培养体系能促进DCs表达NT-3。体外培养48h后，可以观察到DCs与NSPCs共培养组的DCs形态明显趋向成熟。同时共培养体系中DCs的NT-3mRNA表达较DCs单独培养组显著性增高(NSPCs/DCs组2.36±0.14；DCs单独培养组1.17±0.04，p<0.05)。4.体内移植DCs能促进脊髓损伤区NT-3表达。联合细胞移植治疗两周后组织切片观察NT-3表达面积，DCs+NSPCs组损伤位点NT-3较HBSS组(119042.21±10130.23μm2)、DCs组(128985.04±8342.58μm2)、NSPCs组(169729.32±12091.18μm2)具有统计学意义(p＜0.05)。5.与DCs共培养能上调NSPCs的TrkC水平。免疫荧光检查发现NSPCs/DCs组NSPCs细胞球增大，TrkC(CY3红色荧光)表达较NSPCs单独培养组明显增加。RT-PCR结果显示，与DCs共培养能够显著增加NSPCs中TrkC的表达，即NSPCs/DCs组NSPCs的TrkC mRNA水平较NSPCs组增高(p<0.05)；NSPCs/DCs+NT-3抗体组TrkC mRNA表达低于NSPCs/DCs组，显示NT-3抗体能够阻断NSPCs/DCs共培对TrkC mRNA的上调作用。Western blotting证实在蛋白水平具有同样效应。值得注意的是，在NSPCs/DCs+NT-3抗体组，NSPCs TrkC mRNA和蛋白表达水平甚至低于单独NSPCs组，表明NSPCs可能有低水平的NT-3表达。6．与DCs共培养能上调NSPCs的p-TrkC水平。Westerrn blot检测发现NSPCs/DCs组p-TrkC水平高于其余两组(p<0.05)。且变化趋势同TrkC相似。结论1．DCs能促进NSPCs存活。2．其分子机制为：DCs通过分泌NT-3进而激活NSPCs的NT-3/TrkC信号通路，进而促进NSPCs存活。综上所述，本文通过体内外移植、共培养实验，发现DCs能促进NSPCs存活，并且这种效应是DCs分泌的NT-3通过其特有的NT-3/TrkC信号通路实现的。