神经源性肺水肿(Neurogenic Pulmonary Edema, NPE）是中枢神经系统（CNS）疾病的严重并发症之一。是指无原发性心、肺、肾等疾病,由中枢神经系统疾病（如颅脑损伤等）引起的突发性的颅内压增高而导致的肺水肿,也称中枢性肺水肿。近年来,常由发病率显著升高的重症手足口病(EV71感染)导致,使过多的液体蓄于肺间质或肺泡内,形成间质性或肺泡性肺水肿。重症手足口病所致神经源性肺水肿的临床表现为呼吸困难、呼吸窘迫、咳粉红色泡沫痰、咯血、呼吸循环衰竭等急性症状,其发病急,病情较凶险,进展迅猛,治疗困难、死亡率高（90%）~[1]。在医学界,对NPE发病机制的研究一直是比较活跃的一个领域,尽管有许多学者对此已经做了大量的研究工作,但神经源性肺水肿的确切机理至今仍不十分清楚。在其病理改变中，肺部通透性增加是一个特征性的表现。AQP5广泛分布于肺泡Ⅰ型上皮细胞的腔顶面,还位于鼻咽和呼吸道黏膜下腺上皮细胞腔顶面及气道上皮细胞腔膜面，AQP5在肺组织中表达最多。是肺组织水转运功能中液体快速转运的通道,对维持肺组织的正常生理功能、肺水转运中起到不可低估的作用。甲泼尼龙琥珀酸钠是人工合成的糖皮质激素，在治疗手足口病中，是一种常用的物，药作用时间属中效类，具有强大的抗炎作用,可以改善神经传导功能,减轻炎症和水肿[2]，减少儿茶酚胺的缩血管功能和血栓的形成~[3]，能降低毛细血管通透性，减轻肺水肿，同时有效防治脑水肿，阻断肺水肿-脑水肿的恶性循环。本实验通过观察不同剂量的甲强龙（甲泼尼龙琥珀酸钠）对肾上腺素诱导的神经源性肺水肿大鼠肺组织AQP5的表达、病理形态学、湿干重比值等的影响，探讨其对神经源性肺水肿的保护作用，为其临床应用提供理论依据。目的：观察不同剂量的甲泼尼龙琥珀酸钠对肾上腺素诱导的神经源性肺水肿大鼠肺组织AQP5的表达、病理形态学、湿干重比值等的影响，探讨其对神经源性肺水肿是否具有保护性作用差异。方法：1动物模型的制备Wistar大鼠雌雄不拘，1月龄，体重100±8g,腹腔注射肾上腺素造模型，神经源性肺水肿组大鼠按2.7mg／kg给予腹腔注射肾上腺素注射液（1mg:1ml），观察20min左右，大多数大鼠腹腔注射后约5min左右出现呼吸频率加快、弓背,15min可见呼吸困难，若存活时间大于20min者,则造模成功。以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，将麻醉后的大鼠卧位置于操作台上，去毛。取上腹正中切口，打开胸腔，结扎气管，取出双肺。2动物分组将Wistar大鼠50只，随机分为正常对照组(n=10)、神经源性肺水肿组(NPE组，n=10)、甲强龙治疗组(n=30)，后又以不同剂量分为三个亚组，每个亚组10只大鼠。其中甲强龙治疗组于造模后立即腹腔注射。3肺形态观察麻醉大鼠后，迅速开胸，暴露气管，用线扎住气管下端把肺完整地取下,观察肺的颜色和形态。4肺湿干重比检测用吸水纸吸干大鼠右肺中叶表面水分和血液，电子天平称湿重。将右肺中叶置于65℃烘箱内72h至恒重，再称干重，计算右肺中叶湿/干重比值(W/D)。5病理形态学观察分别取左肺放入4%甲醛中固定，4℃存放至肺组织沉到瓶底，之后脱水、透明、包埋、石蜡切片，然后进行HE染色，观察肺组织病理学改变。6肺组织AQP5免疫组化染色采用链霉素-亲合素-生物素过氧化物酶法(SABC)。切片经常规脱蜡、水化后,用3%过氧化氢去除内源性氧化酶,微波抗原修复,余步骤按试剂盒说明书进行。用已知阳性片作为阳性对照,以PBS代替一抗作为阴性对照。AQP5抗体稀释浓度为1：400。光镜下出现细胞胞质呈棕黄色着染者为阳性表达细胞。每张切片随机选择10个视野(200×)测定其吸光度值(absorbance，A)，计算平均A值反映其表达强弱。7实时定量PCR方法检测AQP5mRNA表达取右肺上叶组织，采用TRIzol试剂（购自invitrogen公司）参照说明书提取各组大鼠的肺细胞总RNA,再逆转录成cDNA,以适量cDNA为模板。将配制好的PCR反应溶液置于RealtimePCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件相同。AQP5引物(由invitrogen公司合成),引物序列：GAPDHβ-actin：上游引物5’-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3’;下游引物5’-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3’;(244bp),AQP5上游引物5’-GTGACAGACAAGCCAATGGATAA-3’;下游引物5’-GCCCTCTTAATAGGAAACCAGAT-3’(287bp)。8AQP5Western blot取右肺下叶组织500mg加上1ml提取液用玻璃匀浆器匀浆后提取，4℃,12000r/min,离心5min,取上清液，然后加入等体积的2χSDS上样缓冲液，在100℃水中煮沸5min。进行凝胶电泳，每孔上样等量的总蛋白。将蛋白转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭2h后，加入1:250的第一抗体过夜，再加入1:6500HRP标记的第二抗体，室温振摇2h, ECL显色。使用Gel-pro凝胶分析软件，测定其平均光密度值(OD值)，以光密度值代表AQP5蛋白的表达量。待测AQP5蛋白表达量与内参照β-actin（GAPDH）表达量进行对比，表示AQP5蛋白的相对表达水平。结果：1大鼠一般情况观察NPE组大鼠较对照组呼吸明显加快、躁动，大鼠双肺底可闻及湿罗音；各不同剂量甲强龙(Methylprednisolone MP)治疗组大鼠呼吸无明显加快、躁动，主要表现为活动减少，存活时间延长。2肺组织形态学观察对照组的肺外观呈白色,较实,没有水肿。NPE组双肺体积明显增大、水肿、淤血、表面分布大片状暗红色出血灶,气管内可见泡沫样液体。甲强龙各治疗组较NPE组双肺体积减小，水肿减轻,肺表面散在点状或小片状暗红色出血灶。可见随治疗量增加，出血、水肿明显减轻。3肺W/D重比值NPE组W/D(6.6080±0.4319)与对照组(4.0870±0.5279)相比，明显升高（P<0.05），各甲强龙治疗组W/D比NPE组明显降低（P<0.05），三组相比(5.8279±0.8050)、(5.2430±0.3359)、(4.5900±0.5390)，MP30mg/kg治疗组W/D最低（P<0.05）。4肺组织病理学改变对照组肺泡腔无充血、出血,肺泡结构清晰。NPE组在光镜下肺泡失去正常的结构，肺泡壁增宽，肺泡过度扩张，肺泡腔充满大量出血及炎性细胞。各MP治疗组与NPE组相比，病理改变明显减轻。5肺组织AQP5免疫组化染色免疫组织化学染色结果以IOD值表示AQP5蛋白表达的相对强度,正常对照组肺组织中AQP5在肺泡Ⅰ型上皮细胞的腔顶面有广泛而强烈的表达。NPE组（0.0784±0.0095）与对照组（0.5572±0.0834）相比，AQP5蛋白表达较对照组减少,染色变浅，AQP5表达明显减弱（P<0.05）；甲强龙各治疗组A组、B组、C组(0.2385±0.0676)(0.3441±0.0673)(0.4432±0.0653)较NPE组（0.0784±0.0095）AQP5表达显著加强（P<0.05）；A组、B组、C组(0.2385±0.0676)、(0.3441±0.0673)、(0.4432±0.0653)三组相比，C组(0.4432±0.0653)AQP5密度最高，有统计学意义（P<0.05）。6AQP5mRNA表达水平在287bp处可见AQP5mRNA表达, NPE组与对照组相比，AQP5表达明显减弱（P<0.05）；甲强龙各治疗组较NPE组AQP5表达显著加强（P<0.05）；A组、B组、C组三组相比，C组AQP5mRNA表达水平最高，有统计学意义（P<0.05）。7AQP5蛋白表达水平NPE组（0.2165±0.0202）肺组织AQP5表达与对照组（0.6470±0.1518）相比，AQP5表达明显减少（P<0.05）；甲强龙各治疗组A组、B组、C组（0.3641±0.0202）（0.3788±0.1347）（0.5243±0.0937）肺组织AQP5表达较NPE组（0.2165±0.0202）AQP5表达明显增强（P<0.05）；A组、B组、C组（0.3641±0.0202））（0.3788±0.1347）（0.5243±0.0937）三组相比，C组（0.5243±0.0937）表达明显增强，有统计学意义（P<0.05）。结论：1给予腹腔注射肾上腺素注射液（1mg:1ml），肉眼可见NPE组双肺体积明显增大、水肿、淤血、表面分布大片状暗红色出血灶,气管内可见泡沫样液体。HE染色发现对照组肺泡腔无充血、出血,肺泡结构清晰。NPE组在光镜下肺泡失去正常的结构，肺泡壁增宽，肺泡过度扩张，肺泡腔充满大量出血及炎性细胞。且肺湿/干重比明显增加，综上说明大鼠NPE模型制备成功。2肾上腺素诱导的神经源性肺水肿大鼠肺组织AQP5表达较正常对照组显著降低，提示AQP5在肺脏的水液平衡中起作用，在神经源性肺水肿时是一种保护蛋白。因而我们推测AQP5的表达减少导致肺泡水清除率能力下降，推测可能导致神经源性肺水肿的形成。3在应用甲泼尼龙琥珀酸钠治疗后可使神经源性肺水肿大鼠肺湿/干比值（W/D）降低，AQP5表达上升，肺水肿减轻，说明甲泼尼龙琥珀酸钠对AQP5的表达有上调作用。推测可能通过上调AQP5的含量或者活性,增强肺水肿肺泡水清除率，从而治疗神经源性肺水肿，随着甲泼尼龙琥珀酸钠剂量的增加，AQP5表达增加，肺泡水清除率能力增加，从而肺水肿程度减轻。可能是治疗肺水肿的有效途径。