研究背景子宫内膜癌是常见的妇科恶性肿瘤之一,2012年在世界范围内有约32万例新发病例。子宫内膜癌的发病率和死亡率逐年升高。在美国,2015年有54870位女性被确诊为子宫内膜癌,其中10170名女性死于这一恶性肿瘤,而在2017年有61380例子宫内膜癌新发病例,在妇女所有癌症新发病例中居第四位,其中死亡人数达10920人。子宫内膜癌的预后取决于许多因素,包括肿瘤分期和分级。由于肿瘤复发和转移以及部分患者对激素治疗、放疗和化疗治疗不敏感,子宫内膜癌的总生存时间的中位数缩短。根治性手术是早期子宫内膜癌的一种有效治疗方法,但在手术后约有40%的病例肿瘤短期内发生转移。为了改善患者的预后,在早期诊断不可能的情况下,发现肿瘤转移的分子和信号通路可能会为诊断和治疗提供新的生物学治疗靶向。上皮间质转化（EMT）与癌症的进展和转移有关。常见的EMT在子宫内膜癌中的作用特征已被证实,包括上皮表型E-cadherin表达的缺失,以及间质表型和下游转录因子的增加。最近研究表明子宫内膜癌的EMT调控与PI3K活性、雌激素信号和microRNA（miRNA）的表达有关。EMT也被证明依赖于几种常见的分子标志物的表达,包括snail/slug、Twist、ZEB 1/2和AKT/PI3K,PI3K/AKT/mTOR途径,这些分子标志物也是EMT、细胞增殖和癌症进展的一个重要的细胞周期调控因子。然而,需要进一步的研究来了解这些因素之间的复杂关系。microRNAs（miRNAs）是一组内源性小的非编码RNA,它们通过转录后抑制基因表达或通过结合特定目标基因的3’末端非翻译区域（3’UTR）来影响多种生物进程。最近,由于其已知的转录沉默基因和调控多重信号级联的能力,miRNAs受到了越来越多的全球关注。由于异常的miRNA表达促进了EMT、抗凋亡和血管生成作用,因此miRNA与肿瘤发生、肿瘤转移和疾病进展有关。在过去十年中,癌症研究的主要焦点之一是找出特定的microRNA可以用作生物标志物以及用于临床治疗的抗癌药物。有研究发现miRNA的异常表达参与了子宫内膜癌的发生、发展。也有研究发现miRNA调控子宫内膜癌的EMT,其中调控EMT的最重要的miRNA为microRNA-200家族,但具体调节机制不明确。有研究发现AKT/磷酸化AKT（p-AKT）参与了microRNA-200c（miR-200c）表达的调控,但具体机制尚不明确。BMI-1基因是一种多梳基因（PcG）蛋白,是一种重要的转录抑制因子,调控染色质结构的变化,调节基因活性,许多PcG蛋白在人类癌症中（包括子宫内膜癌）表达发生变化。有研究表明,某些miRNA通过靶向BMI-1基因,抑制癌细胞中的EMT。在子宫内膜癌中BMI-1基因的表达增高还是降低尚存争议,目前在子宫内膜癌中miR-200c对BMI-1基因的靶向作用尚未研究报道。BMI-1基因不仅可以作为预测肿瘤预后的基因,也为恶性肿瘤的靶向治疗提供新的方向。本课题探讨miR-200c与BMI-1基因在子宫内膜癌中的表达情况,分析BMI-1基因与子宫内膜癌临床病理特征的关系及miR-200c与BMI-1基因的相关性,同时在体外研究中进一步研究miR-200c对子宫内膜癌细胞侵袭转移能力的影响,验证miR-200c对BMI-1基因的靶向作用,并进一步验证miR-200c靶向BMI-1基因后通过p-AKT途径抑制子宫内膜癌细胞发生上皮间质转化的机制。第一部分:子宫内膜腺癌组织中miR-200c、BMI-1基因表达及相关性研究研究目的:1.检测子宫内膜腺癌组织和正常子宫内膜组织中miR-200c和BMI-1基因的表达情况及两者的相关性。2.研究BMI-1基因表达与子宫内膜腺癌临床病理特征的关系。研究方法:采用qRT-PCR方法检测60例子宫内膜腺癌和40例正常子宫内膜组织中miR-200c和BMI-1基因相对表达量,采用免疫组织化学方法检测60例子宫内膜腺癌和40例正常子宫内膜组织中BMI-1基因的表达;应用t检验、Spearman统计方法分析miR-200c、BMI-1基因在子宫内膜腺癌和正常子宫内膜组织中表达情况及miR-200c和BMI-1基因的相关性、应用χ2检验/Fisher s检验分析BMI-1基因表达与子宫内膜腺癌临床病理特征的关系。研究结果:1.miR-200c在子宫内膜腺癌组织和正常子宫内膜组织中表达情况:应用qRT-PCR方法检测60例子宫内膜腺癌和40例正常子宫内膜组织miR-200c相对表达量,结果显示:miR-200c在子宫内膜腺癌组织中表达水平与在正常子宫内膜组织中表达水平进行比较,表达下降（P<0.001）。2.BMI-1基因在子宫内膜腺癌组织和正常子宫内膜组织中表达情况:应用qRT-PCR方法检测60例子宫内膜腺癌和40例正常子宫内膜组织BMI-1基因相对表达量,结果显示:BMI-1基因在子宫内膜腺癌组织中表达水平与在正常子宫内膜组织中表达水平进行比较,表达升高（P<0.001）。3.BMI-1基因在子宫内膜腺癌组织中表达与子宫内膜腺癌临床病理特征的关系:将60例子宫内膜腺癌患者根据免疫组化结果分成两组:BMI-1基因高表达组（++/+++）和BMI-1基因低表达组（-/+）。应用χ2检验/Fisher’s检验进行统计分析,结果显示.:在60例子宫内膜腺癌中44例（73.33%）高表达BMI-1基因,40例正常子宫内膜组织中2例（5.00%）高表达BMI-1基因,两者比较差异显著（P<0.001）。BMI-1基因与子宫内膜腺癌患者的年龄（P=0.0102）、FIGO 分期（P=0.0274）、肌层浸润（P=0.0274）、淋巴结转移（P=0.0495）密切相关,与子宫内膜腺癌的分化程度（P=0.088）未发现明显相关性。4.子宫内膜腺癌织中miR-200c表达与BMI-1基因表达的关系:Spearman统计方法结果显示miR-200c与BMI-1基因在子宫内膜腺癌组织中表达呈负相关性（r=-0.4051,P=0.0013）。研究结论:1.miR-200c在子宫内膜腺癌中可能被降解及BMI-1基因的高表达与子宫内膜腺癌的发生有一定的关系。2.BMI-1基因参与子宫内膜腺癌的发生发展过程,促进子宫内膜腺癌的侵袭和转移。3.miR-200c和BMI-1基因在子宫内膜腺癌组织中存在负相关关系,为进一步研究miR-200c对BMI-1基因的靶向作用提供基础。第二部分:MiR-200c靶向BMI-1基因抑制子宫内膜癌细胞上皮间质转化的机制研究研究目的:1.检测miR-200c在子宫内膜癌细胞Ishikawa（高分化）和JEC（中分化）中的表达情况。2.子宫内膜癌细胞Ishikawa和JEC转染miR-200c mimics上调miR-200c表达、转染miR-200c inhibitor抑制miR-200c表达后,检测转染效率3.miR-200c对子宫内膜癌细胞Ishikawa和JEC细胞增殖、侵袭和转移能力的影响4.miR-200c对子宫内膜癌细胞Ishikawa和JEC细胞EMT的影响及BMI-1基因和p-AKT的变化。5.探讨miR-200c靶向BMI-1基因抑制子宫内膜癌细胞Ishikawa和JEC发生EMT的作用机制,验证p-AKT是否参与作用。研究方法:1.采用qRT-PCR方法检测miR-200c在子宫内膜癌细胞Ishikawa和JEC细胞的相对表达量,按照Lipofectamine 2000说明书瞬时转染miR-200c mimics和miR-200c inhibitor 48小时后,qRT-PCR检测子宫内膜癌细胞Ishikawa和JEC的转染效率。2.转染 miR-200c mimics 和 miR-200c inhibitor 后 24h、48h、72h、96h,MTT方法检测细胞增殖能力的影响。3.Transwell小至检测转染miR-200c mimics 和 miR-200c inhibitor 后对子宫内膜癌细胞Ishikawa和JEC细胞侵袭、迁移能力的影响。4.转染 miR-200c mimics 和 miR-200c inhibitor 后 48h,Western-blotting方法检测子宫内膜癌细胞Ishikawa和JEC细胞EMT上皮表型E-cadherin、间质表型N-cadherin、下游转录因子Slug及BMI-1基因、AKT和p-AKT表达情况。5.对转染miR-200c inhibitor的子宫内膜癌细胞ishikawa和JEC细胞,应用siRNA干扰子宫内膜癌细胞中BMI-1基因表达后,Western-blotting方法检测EMT上皮表型E-cadherin、间质表型N-cadherin、下游转录因子Slug变化、检测BMI-1基因干扰效率,检测p-AKT表达变化。研究结果:1.高分化子宫内膜癌细胞Ishikawa和中分化子宫内膜癌细胞JEC细胞中miR-200c表达情况比较:qRT-PCR方法检测高分化子宫内膜癌细胞Ishikawa和中分化子宫内膜癌细胞JEC中miR-200c表达,结果发现miR-200c在两组细胞中表达无明显差异（P>0.05）。2.子宫内膜癌细胞Ishikawa和JEC分别转染miR-200c mimics上调miR-200c表达、转染miR-200c inhibitor抑制miR-200c表达后,转染效率的检测及对细胞增殖能力的影响:转染48小时后,qRT-PCR方法检测转染效率。转染miR-200c mimics明显激活子宫内膜癌细胞Ishikawa和JEC中miR-200c表达（P<0.001）,而转染 miR-200c inhibitor 明显抑制 miR-200c 表达（P<0.001）。转染 miR-200c mimics 和 miR-200c inhibitor 后 24h、48h、72h、96h,MTT 方法检测细胞生长和增殖能力变化,结果显示:转染miR-200c mimics可抑制子宫内膜癌细胞增殖生长,在转染24-48h时对子宫内膜癌细胞增殖抑制能力最强,转染miR-200c inhibitor下调miR-200c表达后可促进子宫内膜癌细胞增殖生长,在转染24-48h时促进细胞增殖能力作用最强。3.miR-200c对Ishikawa和JEC细胞的侵袭和迁移能力的影响:子宫内膜癌细胞Ishikawa和JEC细胞分别转染miR-200c mimics、miR-200c inhibitor、NC 24小时后进行Transwell小室实验检测细胞侵袭迁移能力的变化。结果显示:转染miR-200c mimics上调miR-200c表达后,Ishikawa和JEC细胞的侵袭和迁移能力明显低于对照组（P<0.001）。相反,转染miR-200c inhibitor下调miR-200c表达后,Ishikawa和JEC细胞的侵袭和迁移能力明显高于对照组（P<0.001）。4.miR-200c对子宫内膜癌细胞Ishikawa和JEC细胞EMT的上皮表型E-cadherin、间质表型N-cadherin和下游转录因子Slug的影响及对BMI-1和p-AKT的影响:分别转染 miR-200c mimics、miR-200c inhibitor、NC 和 inhibitor NC 48小时后,Western blotting实验检测EMT的上皮表型E-cadherin、间质表型N-cadherin和下游转录因子Slug的变化及BMI-1基因和p-AKT的变化。结果显示:子宫内膜癌细胞Ishikawa和JEC转染miR-200c mimics上调miR-200c表达后EMT上皮表型E-cadherin表达增强,N-cadherin和转录因子Slug表达下降,同时BMI-1基因和p-AKT表达下降（P<0.001）。转染miR-200c inhibitor下调miR-200c表达后EMT上皮表型E-cadherin表达下降,N-cadherin和转录因子Slug表达增强,同时BMI-1和p-AKT表达增强（P<0.001）。5.miR-200c靶向BMI-1基因抑制子宫内膜癌细胞Ishikawa和JEC发生EMT的作用机制研究:子宫内膜癌细胞Ishikawa和JEC转染miR-200c inhibitor 24小时后,再次通过转染小干扰siRNA BMI-1抑制BMI-1表达,Western blotting实验结果显示:当转染miR-200c inhibitor后再次转染siRNA BMI-1后,原本表达增强的BMI-1基因表达降低（P<0.001）,同时EMT的上皮表型E-cadherin表达增强,N-cadherin和转录因子Slug表达下降,同时p-AKT表达下降（P<0.001）。逆转了原来的只转染miR-200c inhibitor的结果。研究结论:1.miR-200c可能成为抑制子宫内膜癌侵袭转移的治疗靶点。2.miR-200c表达缺失及子宫内膜腺癌组织中miR-200c的降解可能促进了子宫内膜癌的进展和转移。3.P-AKT参与了 miR-200c靶向BMI-1基因对子宫内膜癌细胞上皮间质转化的抑制作用。