研究背景烧伤休克是循环系统功能障碍,而心脏是血液循环的动力器官,心功能的好坏对休克的发生与发展起着举足轻重的作用。黄跃生的研究提示,严重烧伤早期,在血容量明显下降之前,心肌组织即发生了缺血缺氧性损害；导致心肌损害及心功能改变也是诱发或加重休克、导致烧伤早期各脏器缺血缺氧的启动因素之一,即“休克心”假说。严重烧伤可导致“休克心”的发生,造成心肌损害,不仅表现在心肌功能的改变,而且也伴有心肌器质性的改变。然而烧伤早期心肌损害的机制较为复杂,主要表现四个方面：1.心肌缺血再灌流损伤；2.心肌组织水肿；3.心肌细胞氧利用及能量代谢障碍；4.失控性炎症反应。据研究发现烧伤后3小时即可发现明显的心肌组织水肿,而且烧伤休克期后常遗留心肌水肿,从而破坏心肌细胞正常的生命活动；使氧弥散到细胞内距离延长,心肌摄氧量减少,线粒体受损,能量代谢障碍；心肌组织淤血或缺血,加重损伤。随着缺血时间的延长,心肌纤维断裂、微血管损伤,心肌出现无再灌注现象。烧伤后心肌水肿的机制较为复杂。近年研究发现,心肌缺血缺氧性损伤与心肌水肿坏死关系密切。心肌细胞水肿限制了心肌血流及心肌的营养供应,促成了心肌缺血后的损伤。由此可以认为,心肌水肿是心肌缺血再灌注损伤的重要环节,并进一步加剧了心肌缺血缺氧后再灌注损伤的发生和发展。水的跨膜转运有两种基本形式：穿越细胞膜脂质双层的简单扩散和通过介导的水转运,后者是水跨膜转运的主要形式,水通道蛋白的介导是水转运的重要条件。国内外研究已经发现,AQP在脑水肿、肺水肿的形成、尿崩症的发展、肿瘤的转归等方面发挥着重要的作用。AQP是通过增加细胞膜的水通透性而促使在渗透压驱动下的水跨膜转运。其中AQP-1是受到最为广泛和深入研究的水通道亚型之一,也是第一个被证实在渗透压作用下驱动水跨膜转运的AQP。在哺乳动物中,AQP-1广泛地分布于多种组织器官之中,包括红细胞、血管、肾脏、肺部、脑部、眼部和心脏,并且参与了对多种病理生理学功能的调节。进一步的研究发现,在这些组织器官中,AQP-1显著表达于非开窗型毛细血管和微静脉的内皮细胞上。另外,部分非血管组织的内皮细胞(比如眼部的角膜、巩膜和肠道的乳糜管)也存在着AQP-1的表达。基于AQP-1基本生理功能,推测在血管组织内皮细胞上表达AQP-1也可能参与了渗透压跨内皮水转运。研究已经证实,AQP-1是心肌组织中所存在的最主要的AQP亚型,主要集中表达于心肌组织中的微血管内皮细胞和心肌细胞上。多研究结果提示AQP-1在心肌水肿发生过程中起重要作用,如在通过血液稀释所致的长期低渗状态的胚胎心脏的动物研究中发现心肌的水肿伴随了AQP-1基因转录及蛋白表达水平的升高,以及在大鼠急性心肌缺血再灌注损伤研究中也同样发现AQP-1表达增多导致了心肌水肿的发生然而关于烧伤后造成的心肌组织缺血缺氧性损害导致心肌水肿的心肌组织AQP-1表达的动态变化尚未见国内外报道。本实验建立30%TBSAⅢ度烧伤模型,应用免疫组化的方法和ELISA法检测烧伤后心肌组织AQP-1表达的动态变化以及应用干湿重法检测心肌组织含水量的变化。并结合对AQP-1蛋白抑制剂乙酰唑胺的应用,旨在了解AQP-1在烧伤后心肌组织中表达状态的变化规律,并探讨其与心肌水肿的内在联系,为进一步阐明烧伤后“休克心”发生机制提供理论依据。研究目的1.在大鼠烧伤模型中观察烧伤后AQP-1在心肌组织中的分布规律及其表达的动态变化。2.探讨AQP-1蛋白与烧伤后心肌水肿的关系。材料和方法1.实验动物与分组：健康成年Wistar大鼠(由南方医科大学实验动物中心提供)90只,雌雄不拘,体重(210±20)g,按照随机数字表随机分为三组：正常对照组A(n=6)、单纯烫伤组B(n=42)、烫伤加乙酰唑胺组C(n=42)。其中B、C组各设伤后2 h,4 h,8 h,12 h,24 h,48 h和72 h共7个观察时相点,每个时相点为6只大鼠。2.动物模型制作：实验时用3%戊巴比妥钠40 mg/kg行腹腔内麻醉,以10%硫化钠背部脱毛,清水将已脱毛区域洗净后自然晾干。除A组外,将其余各组动物四肢固定,将已脱毛区域置于100℃恒温水浴中15 s,造成实验动物30%TBSAⅢ度烫伤(已经病理证实),伤后按Parkland公式每公斤体重每1%烧伤面积4 ml复方乳酸钠林格液腹腔注射,将总量的一半分为2等份,于伤后即刻和伤后3 h注入,另一半则分为4等份,于伤后8 h,12 h、16 h和24 h注入,伤后第2个24小时,液体量减半,分3次均匀补液。C组烫伤补液同时给予腹腔注射5%乙酰唑胺(100mg／kg·d),伤后30分钟内注射完。3.检测指标及方法：分别于各时相点深度麻醉处死实验大鼠,取左心室心肌组织做光镜病理学观察；采用免疫组织化学法,检测各时相点心肌组织AQP-1分布规律及表达特点；采用ELISA法测定各时相点心肌组织匀浆上清液中AQP-1含量；利用干湿重法计算心肌组织含水量。4.统计分析所有数据用X±S表示。应用SPSS 13.0社会学统计分析软件包进行统计学处理。本实验为3×7*6的析因设计,行完全随机分组两因素析因分析(即two-way analysis of variance),了解各变量之间的主效应和交互作用；各时间组、处理组之间行单项分类的方差分析(one-way analysis of variance);变量间相关性分析采用Pearson相关系数法分析,当P<0.05时,差异有统计学意义。结果1.组织病理形态学观察大鼠烧伤后心肌出现水肿等损害。HE染色结果显示A组心肌结构清晰,心内膜内皮完整,间质结缔组织类未见炎性细胞浸润,无水肿和结缔组织增生,心肌细胞横纹清晰,核居中,心外膜内皮完整,无渗出物被覆和炎性细胞浸润。B组伤后2 h,心肌组织开始出现损伤性病变；伤后8 h,心肌细胞明显肿胀,肌丝排列紊乱,部分肌纤维呈波浪状；伤后12 h,上述病变进一步加重,细胞界限不清,间质血管扩张充血,部分心肌细胞可发现空泡状变性心肌细胞明显水肿,胞体增大,心内膜内皮不完整,大量心肌变性坏死,间质内有大量淋巴细胞、巨噬细胞弥漫性浸润。2.大鼠烧伤后心肌组织AQP-1表达增高。AQP-1在心肌中分布广泛,并且主要分布于心肌血管内皮细胞及心肌细胞膜上。B组烧伤后AQP-1在心肌组织表达呈现增高的趋势。于伤后2 h开始明显增高(9.920±0.40 ng／ml)；12 h达高峰并持续在高水平(19.14±1.01 ng/ml),48 h表达量仍高于正常(13.65±0.45 ng／m1)。C组烧伤后立即给予乙酰唑胺,AQP-1表达在伤后4 h,12 h,48 h分别为10.50±0.49 ng／ml,13.60±0.97 ng/ml,8.73±0.41 ng／ml,各观察时相点心肌组织AQP-1表达量与B组比较明显减少(P<0.01)。显示乙酰唑胺可部分抑制心肌组织AQP-1的表达。3.大鼠烧伤后心肌含水量增多。B组心肌含水量于伤后2 h已出现增多,12 h达高峰(80.79±0.12%),此后逐渐下降,伤后48 h为76.93±0.1%,仍高于A组(73.29±0.04%,P<0.01)。而C组心肌含水量8 h、12 h、48 h分别为75.49±1.09%,76.49±1.1%,74.59±1.04%,较B组明显减轻(P<0.01),显示乙酰唑胺干预可降低大鼠烧伤后心肌含水量。4.对大鼠烧伤后心肌组织AQP-1表达变化与心肌组织含水量进行相关性分析(r=0.844,P<0.01),二者之间存在显著正相关关系。且AQP-1抑制剂乙酰唑胺可抑制大鼠烧伤后心肌组织AQP-1的表达和心肌水肿的发生。结论1.大鼠心肌组织存在着AQP-1表达,以微血管内皮细胞及心肌细胞肌膜为主。2.烧伤后大鼠心肌组织AQP-1表达明显增强。给予AQP1抑制剂乙酰唑胺可明显降低烧伤大鼠心肌组织AQP-11的表达。3.大鼠烧伤后心肌组织AQP-1表达增多与心肌水肿呈正相关,AQP-1抑制剂乙酰唑胺通过抑制AQP-1表达,减轻心肌水肿。提示AQP-1在大鼠烧伤后心肌水肿发生和发展过程中起重要作用。