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研究背景:靶向治疗有望成为晚期肝细胞癌的重要治疗手段。溶酶体跨膜蛋白4β受体(lysosomal protein transmembrane 4 beta,LAPTM4B)在肝细胞癌细胞表面高表达而在正常肝细胞表面不表达,有望成为肝细胞癌的靶向治疗靶点。多肽AP2H(氨基酸序列为:IHGHHIISVG)是针对LAPTM4B受体的细胞膜外片段EL2设计的特异性反义靶向肽。采用5-羧基荧光素(5-carboxyfluorescein,FAM)和正电子核素18氟(18F)、68镓(68Ga)标记该靶向多肽制备分子探针,有望实现在活体上将该靶点的表达可视化,从而用于诊断并指导相应的靶向治疗。研究目的:1.合成多肽AP2H并用FAM标记制备荧光探针(FAM-AP2H),从细胞学、组织学及动物显像等论证该探针的LAPTM4B受体靶向特异性。2.研究AP2H的18F、68Ga标记方法学,研制PET分子探针,通过micro PET/CT显像无创性地将肿瘤的LAPTM4B受体表达可视化。3.探索如何减少肝胆排泄以提高肿瘤显像效果。研究方法:一、采用固相合成法合成AP2H,FAM-AP2H并对多肽进行分离纯化及分析鉴定。二、采用免疫荧光方法确认肿瘤细胞高表达LAPTM4B。通过孵育,研究FAM-AP2H与肝癌细胞的结合情况。并采用CCK-8法,对AP2H与FAM-AP2H是否存在细胞毒性进行确认。三、建立HepG2、BEL-7402、U87MG裸鼠肿瘤模型,通过组织免疫病理检查确认其LAPTM4B表达。四、进行肝细胞癌肿瘤模型的FAM-AP2H荧光显像研究。五:制备受体靶向肽探针:[18F]-FP-AP2H、[18F]AlF-NODA-MP-C6-AP2H、[68Ga]Ga-NODA-MP-C6-AP2H、[18F]-FP-GGGRDN-AP2H并研究肿瘤模型的microPET/CT 显像结果:一、成功合成了多肽AP2H和FAM-AP2H,纯度分别为98.89%和98.64%,主峰分子量(m/z:Da)分别为1069.7和1427.9,与理论分子量1069.24和1427.56相符,满足实验要求。二、Cy3体外免疫荧光实验,肝细胞癌细胞系BEL-7402及HepG2的细胞膜及细胞浆内均见到浓染的红色荧光,提示这两种细胞均有LAPTM4B受体大量表达。人正常肝细胞L-02仅见到少许红色荧光,提示L-02细胞的LAPTM4B受体表达量极低。三、体外细胞摄取及抑制实验,细胞浓度为1×104个/ml,多肽浓度从OμM、2.5μM、5μM、10μM、20μM、40μM、80μM逐渐升高,荧光显微镜下发现肝癌细胞的荧光强度依次增强,多肽主要定位于细胞膜,当浓度为40μM时细胞摄取荧光多肽的相对荧光强度基本达到饱和。抑制实验:当抑制多肽浓度达到荧光多肽浓度的10倍以上,HepG2细胞摄取荧光探针明显降低。通过流式细胞学定量测定,HepG2细胞荧光结合率从0%逐渐上升,在40μM时候荧光结合强度接近100%。其细胞摄取特点符合受体-配体结合的饱和曲线。而人正常肝细胞L-02未见到明显的荧光结合,符合受体-配体结合的特异性。四、CCK-8法研究AP2H,FAM-AP2H两种多肽对HepG2的毒性,细胞的存活率均在80%以上。五、采用尾静脉注射给药法,将FAM-AP2H注入荷瘤裸鼠体内,5h后处死,取各脏器荧光计数值的平均数进行计算,荷HepG2裸鼠的靶/非靶比值依次为:肿瘤/正常肝脏=1.68±0.48,肿瘤/脑=1.36±0.35,肿瘤/心脏=2.07±0.67,肿瘤/肺=1.75±0.40,肿瘤/脾脏=2.18±0.64,肿瘤/肾脏=0.93±0.08,肿瘤/小肠=0.51±0.28,肿瘤/肌肉=1.63±0.42。BEL-7402裸鼠的靶/非靶比值依次为:肿瘤/正常肝脏=1.36±0.21,肿瘤/脑=1.28±0.15,肿瘤/心脏=1.75±0.54,肿瘤/肺=1.61±0.18,肿瘤/脾脏=1.96±0.30,肿瘤/肾脏=0.96±0.17,肿瘤/小肠=0.39±0.20,肿瘤/肌肉=1.91 ±0.73。从体内分布看,该荧光探针主要通过胆道系统代谢。六、成功合成[18F]-FP-AP2H、[18F]AlF-NODA-MP-C6-AP2H、68Ga-NODA-MP-C6-AP2H,[18F]-FP-GGGRDN-AP2H。经衰减校正的产率依次约为15%,30%-40%,90%,15%。产物峰单一,与未标记前的多肽出峰位置基本相同。在室温下、生理盐水中静置4h后通过HPLC测定,产物稳定。七、荷HepG2和BEL-7402肿瘤模型的裸鼠经尾静脉注射放射性药物60min后进行 micro PET/CT 显像,[18F]-FP-AP2H、[18F]AlF-NODA-MP-C6-AP2H、[68Ga]Ga-NODA-MP-C6-AP2H、[18F]-FP-GGGRDN-AP2H 在 HepG2 肿瘤内百分注射剂量(%ID/g)依次为 3.70±0.56%ID/g,1.33±0.12%ID/g,2.20±0.55%ID/g,1.70±0.27%ID/g。其肿瘤/肝比值依次为 0.81 ±0.06,2.00±0.52,1.10±0.07,1.71 ± 0.33。经尾静脉注射[18F]AlF-NODA-MP-C6-AP2H、[18F]-FP-GGGRDN-AP2H 60min 后 BEL-7402 裸鼠肿瘤内的百分注射剂量(%ID/g)为 1.00±0.26,2.20±0.61。其肿瘤/肝比值为 2.33±1.15,1.60±0.13。八、荷U87MG裸鼠肿瘤模型经尾静脉注射[18F]AlF-NODA-MP-C6-AP2H约60min后进行micro PET/CT显像,肿瘤的百分注射剂量(%ID/g)为1.50±0.53。其肿瘤/脑比值为20.74±5.94。结论:1.成功合成了 AP2H、FAM-AP2H、NODA-MP-C6-AP2H,纯度达到 98.89%、98.23%和 95.8807%。2.体外实验FAM-AP2H能与肝癌细胞结合,其结合符合受体-配体结合规律。3.荷瘤鼠体内分布显示FAM-AP2H能特异性靶向肿瘤病灶。4.成功合成了[18F]-FP-AP2H、[18F]AlF-NODA-MP-C6-AP2H、[68Ga]Ga-NODA-MP-C6-AP2H、[18F]-FP-GGGRDN-AP2H,通过 micro PET/CT 显像证明该探针可以特异性靶向肝细胞癌病灶。