草甘膦是当前应用最多的广谱灭生性有机磷类除草剂,生产上大面积使用的抗草甘膦转基因作物主要是利用了根癌农杆菌CP4的EPSP合酶基因,但该基因及其一系列突变基因已有专利保护,利用不便,发掘抗草甘膦新基因、培育转基因新材料十分必要;另一方面,研究极端草甘膦浓度下生物的差异基因有助于深入了解抗性形成的分子机制,可为抗性利用或抗性杂草防控提供有用信息。本研究以挖掘抗草甘膦优异基因为目标,首先从微生物和植物中筛选和诱发抗草甘膦资源,对其进行特性鉴定;根据抗性表现,重点对一株耐高浓度草甘膦的肠杆菌突变菌Enterobacter sp.NRS-1(简称为NRS-1)进行表达谱芯片分析,研究其在草甘膦处理下的应答基因;进一步模拟高浓度草甘膦逆境,设计渗透、酸等处理,对NRS-1进行转录组测序,分析其对短时间草甘膦逆境的应答基因及调控网络,研究重要基因功能,以期深入了解NRS-1对草甘膦耐性的分子基础,为进一步发掘和利用耐性基因提供参考。获得主要结果如下。1.耐草甘膦生物的发掘及肠杆菌突变菌株NRS-1的特性鉴定通过在培养基中不断加大草甘膦浓度筛选抗性微生物,结果发现1株肠杆菌属革兰氏阴性细菌能够在含110g/L草甘膦的培养基中生存,该菌株命名为Enterobacter sp.NRS-1(简称为NRS-1),是后续研究的重点。另发现4株真菌能在含60g/L 草甘膦培养基中生长,其中1株属麦角菌属(命名为NRS-2),1株为青霉(NRS-3),另2株为曲霉(NRS-4、NRS-5)。比较NRS-1及其筛选前菌株在60g/L草甘膦(60-NPG)及模拟60-NPG下渗透(NaCl,355mM)、酸(HCl,pH=4.46)逆境处理下的生长曲线,筛选前菌株在草甘膦逆境下无法繁殖生存,但在NaCl、HCl处理下与NRS-1的生长趋势相似,表明NRS-1在草甘膦筛选前可能已有对渗透与酸逆境的耐性,经筛选后获得对草甘膦的耐性。透射电镜结果显示NRS-1在60-NPG逆境下未出现细胞膜的损害等,只有少量内含物的外渗,说明细菌对60-NPG有很强的耐性。在极端逆境 110g/L 草甘膦(110-NPG)、NaCl(430mM)、HCl(pH=3.9)、H2O2(9mM)处理下,NRS-1与筛选前菌株的生长存在很大差异。草甘膦逆境下筛选前菌株不能生存,而NRS-1仍能缓慢生长。筛选前菌株在临界NaCl和HCl浓度下繁殖能力强,恢复快,说明其对高渗透和酸逆境耐性强,而NRS-1在极端NaCl、HCl单独逆境下受害较严重,生长缓慢,表明细胞获得耐草甘膦特性的同时,抵御高渗和酸逆境的能力降低。在H202极端氧化胁迫下,生长曲线显示NRS-1在处理早期能增殖,而筛选前菌株在经过较长时间的抑制后才缓慢增殖。测序发现NRS-1的EPSPS基因第179个氨基酸处苏氨酸突变为丙氨酸,使草甘膦敏感型EPSPS基因突变为抗性基因,qPCR结果表明靶基因能够通过增加表达量提高细胞对草甘膦的耐性。草甘膦逆境处理后NRS-1的质粒拷贝数增加,其对细胞的草甘膦耐性可能有一定作用。对南京大豆田耐草甘膦杂草进行调查鉴定,经常用浓度(150-200mL/亩)草甘膦喷洒处理后,有14种杂草能够存活,其中小飞蓬、铁苋菜、紫菀等具有较好的抗性。抗性杂草多具有种群大、根茎粗壮等特点,田间抗药性可能与这些形态相关。2·高浓度草甘膦处理下NRS-1的表达谱及重要应答基因的功能分析经较长时间60-NPG处理和对照NRS-1的表达谱芯片结果比较分析,发现42个差异应答基因,其中25个基因有功能注释(4个下调表达,21个上调)。下调基因能节省能量、物质等而影响细胞的抗逆、代谢、生长速率及繁殖等,如sdhA下调表达会降低细胞代谢和生长速率,进而降低逆境对细胞的影响。上调表达的基因有积极保护细胞的作用,如基因pflB能为细胞提供必需的能量;fusA促进蛋白质的合成。利用ClueGo软件分析发现所有差异基因都与核糖体有关,它们通过参与不同的代谢途径形成代谢网络。草甘膦靶基因aroA与ilvB、argF、rpsL、rrA-L、speA、uxaC间在代谢网络上有重叠,同时除核糖体基因外,其参与的过程还与sdhA、pflB、ahpC、rpoD、doA、osmY有间接联系。这些基因所参与的途径可能涉及芳香族氨基酸及其衍生物的功能。对deoA、fusA、osmY、argF、sdhA与aroA基因进行细菌双杂实验,未发现基因间存在直接的互作。根据差异基因在KEGG中的具体功能分析,提出NRS-1中的基因可能从4个方面抵御草甘膦逆境。首先是细胞膜水平,其次是从代谢水平维持细胞内的各种平衡,这是最重要的一层保护,第三、四方面的保护主要是起调节作用的基因以及核糖体相关基因,是逆境下微生物生存的基础。选择5个与耐逆相关的差异基因进行功能验证,植物和原核表达结果表明这些基因对草甘膦的抗性有一定的作用。在转基因拟南芥中,各基因对草甘膦的耐性表现为aroA≥argF≥deoA>sdhA GFP(空载对照)≥fusA>osmY,表明草甘膦处理会影响转基因植株氨基酸的合成或利用,包括芳香族氨基酸、含有胸腺嘧啶的相关氨基酸以及精氨酸。上述6个基因的转化菌株在草甘膦逆境下的生长情况都优于对照,表明这些基因对提高草甘膦耐性有作用。3.逆境处理下NRS-1的转录组特点对60g/L、l10g/L草甘膦处理及NaCl、HCl、H202处理(模拟60-NPG下存在的渗透、酸等逆境)的NRS-1样本进行转录组测序。与对照的相比,在NaCl、HCl、60-NPG、110-NPG处理下共获得了 238、193、191、170个差异表达基因。60-NPG与110-NPG间的差异基因中,有30个相同的上调基因,45个相同的下调基因;60-NPG和110-NPG下各有116、95个为特异性差异基因,所占比例相对较高。60-NPG与渗透、酸逆境处理相比,分别有11、53个相同的上调基因,64、75个相同的下调基因;有30和25个基因在60-NPG逆境下特异性上调和下调。此外,在短时间的H2O2处理下,共获得113个差异基因,表达变化较大的基因有5个,包括上调基因aceE/F,与丙酮酸脱氢酶相关;下调基因cox1、cox2、cox3,与细胞色素C氧化酶相关。根据草甘膦靶标途径中差异基因的功能分析NRS-1耐草甘膦的机理,结果显示60-NPG 下的ar aroK、aroG,110-NPG 下的 aroE、aroQ,NaCl,HCl 处理下的aroE参与莽草酸途径。比较NaCl、HC1、110-NPG、60-NPG处理下的测序数据,发现转运蛋白、甲硫氨酸及其衍生物合成基因、甲酸脱氢酶合成基因等对草甘膦有特异性应答,其对NRS-1耐草甘膦特性的作用值得重视。60-NPG、110-NPG两种处理下相同的差异基因有arcA、arcB、fdhF 等;而不同的差异基因中很多与能量、碳源的获得相关。在高浓度(110-NPG)的草甘膦中,NRS-1无法较好的吸收体外氨基酸,细胞上调大量蛋白质合成相关基因和双成份应答体系相关基因narJ/X/K/H/G、cheZ、uhpA;60-NPG下,细胞启动更多与细胞膜结构相关的保护,更多铁离子被吸收,Fe-S中心的合成增多,参与的基因包括entS、entE、fepA、fepB、feoB、sufD。此外,许多差异基因与药物抗性相关,如含磷化合物代谢(arcB、citA、cpxA、glpD),水解酶(arcA、ascB、atpB、cpdB),裂解酶(citF、dsdA、fhlA、maeA)等相关基因,它们表现为对特定或多种逆境的抗性。研究细胞耐氧化胁迫下基因组的转录变化以验证NRS-1已发生遗传性的代谢变化以提高细胞耐草甘膦的能力。在H2O2处理下,根据基因具体功能,细胞内发生的变化主要分为13类,下调变化包括转录因子,水解酶,与分泌、物质输入/代谢、氮素、物质合成、结构相关的过程,上调变化包括甲酸脱氢酶,与铁离子,多种药物抗性,抗氧化,损伤修复,能量产生相关的过程。NRS-1抗氧化胁迫的应答基因中未出现oxyR、soxR/S、rpoS、perR等重要的抗氧化胁迫调控基因,表明在进化过程中,NRS-1的部分代谢系统发生改变,影响了细胞对其他逆境的应答。将60-NPG下NRS-1转录组测序与表达谱芯片数据比较以了解细胞对不同时间草甘膦处理的应答反应,结果表明2种实验中下共有12个相同的差异基因。osmY、frdA、pckA3个基因在2种处理下表达模式相同,fusA、icd、nupC、rplD/E、rpsG/H/J、yagG等9个基因的表达模式不同。