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丝氨酸水解酶（SHs）主要包括代谢性丝氨酸水解酶（mSHs）和丝氨酸蛋白酶两大类。mSHs与许多生理和病理代谢通路有关,而且它们的底物与亲核丝氨酸之间的催化循环反应极其相似。在本课题中,我们采用基于活性的方法,以氨基甲酸酯探针为底物,通过控制氨基甲酸酯探针与mSHs相互作用的氨基甲酰化速率和脱氨基甲酰化速率,选择性地将mSHs从复杂的蛋白质组中分离。为了测试该方法的可行性,我们以人丁酰胆碱酯酶（hBChE）作为模型mSHs,以人血浆作为模型蛋白质组进行研究。氨基甲酸酯探针以hBChE抑制剂班布特罗单氨基甲酸酯（MONO）为结构基础,通过去掉MONO的支链甲基及增加间隔臂得到目标氨基甲酸酯探针化合物,并将该化合物固定在载体上得到具有反应性的亲和吸附剂。通过比较MONO和氨基甲酸酯探针与hBChE之间的相互作用动力学发现这两种化合物与hBChE作用时的二级氨基甲酰化速率常数（k I）值相近,而氨基甲酸酯探针与hBChE作用时的脱氨基甲酰化速率常数（k3）值比MONO高,表明该探针可与hBChE快速反应,且酶活性的恢复速率比MONO快。为了测试该方法的性能,我们以带有氨基甲酸酯配基的亲和吸附剂为亲和色谱基质,使用一系列一步纯化法对血浆中的hBChE进行分离,通过hBChE活性测试,非变性凝胶电泳,银染和BChE活性染色法,Bradford蛋白定量法和基于UPLC-Q-TOF/MS的相关蛋白质组学分析法对所分离出的蛋白进行定性和定量分析,结果表明:1)hBChE在亲和吸附剂上的保留机制与其活性位点有关,亲和吸附剂上的氨基甲酸酯探针是hBChE保留的必要条件,且hBChE与亲和吸附剂之间的结合方式为共价键。与其它文献报道的方法相比,该氨基甲酸酯探针可以保留和释放所有不同形式的hBChE同工酶,如单体、HSA-BChE复合物、二聚体、三聚体和四聚体,而其它方法仅能保留和释放hBChE四聚体。2)吸附和洗脱过程中的孵育时间、孵育温度及洗脱液的种类、浓度和温度是影响该亲和吸附剂纯化性能的主要因素。最有效的洗脱液是四甲基氯化铵（4MAC）溶液。在吸附过程中,随着孵育时间的增加,杂蛋白的吸附量显著增加而hBChE的吸附量并没有显著增加,表明该氨基甲酸酯探针对hBChE有较高的氨基甲酰化速率。在洗涤过程中,与温度为4°C,pH值为5的缓冲液相比,温度为37°C,pH值为7的缓冲液能更加有效地去除杂蛋白。当使用最优的色谱条件对血浆中的hBChE进行分离时,hBChE的回收率和表观纯度均约为30%,hBChE的纯化因子约为850倍,当使用在固态基质Sepharose CL-4B上逐步偶联探针化合物的亲和吸附剂,并增加上样次数时,hBChE的纯化因子可提高至约2500倍,但hBChE的回收率会相应地减少。在保证亲和吸附剂纯化性能的前提下,经计算,每g亲和吸附剂能处理大约8.5 mL血浆样品。3)分离出的蛋白样品中除了hBChE外,还包含其它三种高丰度的血浆蛋白,据推测,这三种蛋白可能为:HSA、IgG和IgM。根据半定量结果进行计算,发现样品中高丰度血浆蛋白HSA和Igs的含量均低于其初始上样量的0.05%。综上所述,这些结果均证实了该氨基甲酸酯探针对hBChE的高效选择性,同时,也表明高丰度的血浆蛋白HSA和Igs与该氨基甲酸酯探针具有一定的反应性。由于该方法基于丝氨酸水解酶的通用催化机制,本研究可以为使用氨基甲酸酯探针分离其它mSHs新方法的开发提供新的研究思路。