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骨的生理性改建是口腔正畸牙齿移动的基础,因而骨的生长与代谢直接或间接地影响正畸的疗效。口腔正畸过程中牙齿在骨组织中的移动主要是通过骨的形成和吸收来完成的。雌激素作为调控骨改建的重要条件之一是通过雌激素受体完成的,然而雌激素受体β是否参与介导骨髓间充质干细胞的增殖与分化,至今仍有待于进一步的实验论证。本研究采用siRNA技特异性术对雌激素受体β进行干涉,并稳定转染入分离培养的骨髓基质干细胞中,观察其在成骨和成脂肪分化平衡的作用。研究内容如下:1.SiRNA ERβ特异性表达载体的构建与鉴定根据siRNA的设计原则,以ERβ基因的RNA序列为靶序列,实验设计了三对特异性siRNA干扰序列,经DNA测序,结果显示所插入序列与合成序列完全相同,证明载体构建正确。2.不同年龄骨髓间充质干细胞成骨与成脂分化平衡的研究采用全骨髓自然贴壁筛选法从不同年龄的雌性SD大鼠股骨中分离、纯化培养出BMSCs,并通过倒置显微镜观察、MTT细胞生长曲线等生物学行为观察,初步判断其活力和均一性。再经成骨、成脂等多向分化诱导,获得了茜素红染色的类成骨细胞和油红-O染色的类脂肪细胞。采用图像分析软件进行分析,计算出矿化率和成脂率。结果表明随着年龄的增加成骨能力减弱而成脂肪能力增强。骨髓中的脂肪细胞增多可能是促成增龄性疾病-骨质疏松的原因。3.雌激素受体β与大鼠骨髓基质干细胞成脂肪分化相关性研究通过对大鼠骨髓基质干细胞成脂肪分化过程中雌激素受体β表达规律的研究,进一步明确雌激素受体β与骨代谢的的相关性。大鼠骨髓基质干细胞培养,成骨诱导分化,钙染色。成脂肪诱导分化,油红O染色。Western blot方法测定大鼠骨髓基质干细胞成脂肪分化过程中雌激素受体β的表达。全骨髓贴壁的方法培养获得大鼠骨髓基质干细胞。成脂诱导分化显微镜下脂肪滴、油红O染色阳性细胞随成脂肪时间增加而增多。雌激素受体β的表达随成脂时间的增加而递增。大鼠骨髓基质干细胞成脂肪分化过程中ERβ的表达随时间逐渐增加。4 ER-β特异性siRNA对rBMSC成骨与成脂肪分化影响的研究转染siRNA ER-β骨髓基质干细胞在雌激素条件下进行成骨诱导分化,应用试剂盒检测碱性磷酸酶活性和茜素红方法染色钙化结节,而成脂肪诱导分化后也应用Pt-PCR技术检测脂蛋白脂肪酶含量和油红-O方法染色脂肪颗粒。结果显示雌激素受体β干涉后的骨髓基质干细胞诱导成骨后碱性磷酸酶活性增强钙化结节也见增多,而诱导成脂肪后LPLmRNA表达量显著降低油红-O染色阳性细胞数也明显减少。故而可以得出结论:雌激素受体β在骨髓基质干细胞成骨和成脂肪分化分化过程中可能起到关键的作用,它的表达量可能调节骨髓基质干细胞的成骨与成脂肪分化平衡。