随着新型候选标志物的不断发现和验证,适用于大量临床样本筛查和多种标志物联合定量检测的需求日益增加,夹心法抗体微阵列(Array-ELISA)正在逐渐地体现出它的技术优势和应用前景；而如何根据特定研究对象,自主构建Array-ELISA测定方法则是发展该项技术的核心所在。受限于抗原和抗体的数量和质量,目前针对新型候选标志物的Array-ELISA技术开发尚缺少系统性的研究。本课题以胃癌相关的蛋白质候选标志物为研究对象,以系统分析和解决Array-ELISA测定中的技术问题为切入点,试图自主构建胃癌候选标志物的Array-ELISA方法,并初步开发不同候选标志物组合在胃癌血清学检测中的应用。我们首先根据本实验室的发现以及文献报道,筛选多个胃癌相关的候选标志物。立足于大规模重组蛋白质和抗体的制备,我们获得了大量的针对不同候选标志物的高专一性抗原和抗体。我们进一步开展了规模化的抗体配对筛选,以期得到同一候选标志物的多重配对抗体；并在此基础上对多种候选标志物的Array-ELISA构建过程进行一系列的优化和评价,保证了Array-ELISA的定量重现性和准确性。最后,我们将自主构建的Array-ELISA测定方法应用于临床血清筛选,初步评价了新型候选标志物以及标志物组合在胃癌血清学检测方面的潜在价值。针对筛选的胃癌候选标志物,我们一共制备了27种标志物的43个重组抗原蛋白质、26种标志物的72个鼠源单抗和23种标志物的23个兔源多抗。在抗体配对筛选方面,我们获得了15种标志物的18个捕获单抗-检测多抗配对、15种标志物的18个捕获多抗-检测单抗配对和10种标志物的37个捕获单抗-检测单抗配对。筛选合格的配对抗体是多重免疫测定技术建立的基本要求,而合格的配对抗体又取决于它们的免疫测定过程中所具备的低背景干扰。因此,我们聚焦于配对抗体所产生的高背景干扰的原因,并进一步发展了改善抗体配对成功率的方法。我们发现,高背景干扰可能与抗体的亲和蛋白纯化过程或者酶标二抗的跨物种交叉反应之间没有直接关系,但是与抗体的小鼠腹水制备过程密切相关。我们首次提出了实验动物来源的亲异嗜性抗体污染是导致配对筛选高背景的重要原因之一。对于采用小鼠腹水生产的单克隆抗体的配对过程,我们采用非免疫小鼠血清封闭和抗原亲和层析纯化抗体等方法就能够有效地降低乃至消除亲异嗜性抗体的背景干扰。经过点样、反应条件、非特异性吸附、交叉反应等一系列的优化工作,我们成功建立了可针对6种胃癌候选标志物联合定量筛查的Array-ELISA技术,点样变异系数不高于5%,检测灵敏度最低可达10 pg/mL,动态范围为4个数量级。我们将另一组含6种胃癌相关标志物的Array-ELISA应用于70例血清样本的初步筛查,发现MMP11、CCN1、 PRDX6、和PGC四种标志物的联合检测可达90%以上的胃癌预测灵敏性和特异性。我们进而针对MMP11、GKN1、REG4、CK8和OPN五种候选标志物开展了Array-ELISA定量分析。在通过80例血清样本的筛选中,确定了这5种候选标志物对胃癌的预测可达到67%的灵敏性和80%的特异性。上述胃癌候选标志物的Array-ELISA初步筛查结果预示着该方法有较大的潜在应用价值；随着更深入的技术优化以及大规模样本的测试,建立胃癌相关的高质量预测模型和常规的临床检测技术是完全可以期望的。