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为了进一步揭示沙蚕CYP4对多环芳烃的代谢及解毒机制,并为沙蚕在海洋沉积环境早期生态风险评价中的应用提供理论依据。本研究根据已有双齿围沙蚕(Perinereis aibuhitensis)细胞色素氧化酶CYP4全序列进行开放阅读框扩增,通过体外构建原核表达系统,获得沙蚕CYP4体外重组蛋白。在此基础上探讨了两种多环芳烃(苯并(a)芘及菲)诱导下沙蚕CYP4转录及翻译水平的表达规律。具体结果如下:(1)本研究利用表达载体pET-28a和大肠杆菌BL21感受态细胞构建了沙蚕CYP4体外表达系统。重组蛋白体外诱导表达最适表达温度为37℃,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)最佳诱导浓度为0.8mmol/L。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测显示表达蛋白为包涵体。对目的蛋白进行纯化及复性,通过免疫家兔,获得沙蚕CYP4的多克隆抗体。(2)利用荧光实时定量PCR检测方法分析了苯并芘(B(a)P)暴露下双齿围沙蚕CYP4转录水平的变化趋势。第4d时,0.5和50μg/L浓度组的沙蚕CYP4基因的表达量上调,其中0.5μg/L浓度组与空白对照组存在极显著差异(P<0.01),其它浓度组与空白对照组未见明显差异。至第7d,各浓度组CYP4基因表达与对照组相比出现明显升高趋势,并且CYP4基因的表达量与B(a)P浓度成正比。其中,10μg/L和50μg/L浓度组与对照组差异显著(P<0.05),50μg/L浓度组与空白对照组有极显著差异(P<0.01)。至第14d,各浓度组的CYP4基因的表达量均相对下调,其中5μg/L和50μg/L浓度组的CYP4基因表达量显著低于空白对照组(P<0.05),其它两个浓度组与空白对照组则无显著差异。(3)利用荧光实时定量PCR检测方法分析了菲暴露下双齿围沙蚕CYP4转录水平的变化趋势。菲诱导双齿围沙蚕CYP4基因表达水平的变化与苯并芘作用不同,至实验第4d,各浓度组的CYP4基因表达均表现为下调,且随菲浓度的增加表达量逐渐降低;四个浓度组的CYP4基因表达量均极显著地低于空白对照组(P<0.01)。至第7d时,50μg/L浓度组CYP4基因表达量最高上调明显,与空白对照组存在极显著差异(P<0.01),其它浓度组CYP4基因的表达量均上调不明显。至第14d时,各浓度组的CYP4基因表达量均低于对照组,且各组之间无太大差异。(4)利用间接ELISA检测方法分析了苯并芘(B(a)P)暴露下双齿围沙蚕CYP4翻译水平的变化趋势。第4d时,各浓度组间CYP4蛋白表达量无显著性差异。至实验第7d,5μg/L浓度组CYP4蛋白的表达量显著降低,与对照组存在极显著差异(P<0.01),其它浓度组与对照组均无显著差异。第14d时,50μg/L浓度组CYP4蛋白表达量最高,其次为5μg/L浓度组,且与对照组存在显著性差异(P<0.05),其它两组与对照组无显著差异。(5)利用间接ELISA检测方法分析了菲暴露下双齿围沙蚕CYP4翻译水平的变化趋势。在4d时,CYP4蛋白表达量均低于对照组,并且随菲浓度的升高呈递减趋势,5μg/L和10μg/L浓度组CYP4蛋白表达量均与对照组存在显著性差异(P<0.05),而50μg/L浓度组与其它浓度组相比CYP4蛋白表达量最低,与空白组表现为极显著性差异(P<0.01)。在7d时,5μg/L和10μg/L浓度组CYP4蛋白表达量均显著降低,与对照组存在显著性差异(P<0.05)。14d时,5μg/L浓度组表达量达到最低仍显著降低(P<0.01),其它浓度组与对照组无显著差异。在苯并芘与菲的诱导下,双齿围沙蚕CYP4mRNA的表达量与蛋白的表达量表现为不一致,由此得出mRNA的表达与蛋白表达不是简单的线性关系,蛋白调控是多层次的,转录水平的调控只是一个层面,而本研究也为以后双齿围沙蚕相关蛋白调控的研究奠定了基础。