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背景和目的：心肌细胞(Cardiomyocytes,CMs)凋亡是多种心血管疾病的重要病理生理机制之一。microRNA是真核生物中一种长度约为22个核苷酸大小、参与基因转录后调控的非编码单链小分子RNA，可特异性识别靶信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid,mRNA)的3’-非编码区(3’-UTR)并与之结合，从而降解靶mRNA、抑制翻译，发挥其对基因的转录后表达调控，调节重要的细胞活动，参与众多疾病的病理生理过程。在众多微小RNA(microRNA,miRNA)中，微小RNA-21(microRNA-21,miR-21)不仅在心血管系统中呈高表达，而且还在许多心血管疾病如心肌梗死、心力衰竭、心脏肥大上呈差异性表达，参与各种心血管疾病的病理生理分子机制。迄今为止，研究发现miR-21介导的心血管效应的靶基因有四个，分别是程序性细胞死亡因子4(PDCD4)，磷酸脂酶-张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome10,PTEN)，Sprouty1(SPRY1)和Sprouty2(SPRY2)。这四个靶基因具有明显细胞和条件特异性。PTEN/AKT/FOXO3a通路是调控细胞凋亡的重要通路之一。本研究旨在通过构建过表达miR-21重组慢病毒载体，并转染至原代培养心肌细胞中，初步探讨过表达miR-21重组慢病毒载体转染心肌细胞后对TNF-α (10ng/ml)诱导的心肌细胞凋亡的影响，并从基因和蛋白水平进一步探讨PTEN是否为miR-21对TNF-α诱导的心肌细胞凋亡的影响中的靶基因及PTEN/AKT/FOXO3a信号转导通路是否参与miR-21对TNF-α诱导的心肌细胞凋亡的影响。旨在为miR-21未来治疗干预心血管疾病提供新的靶点。方法：应用PCR技术体外合成pre-microRNA-21对应的基因组片段，定向克隆到pGC-FU-绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)重组慢病毒载体上，构建过表达miR-21重组慢病毒载体。原代分离培养及心肌肌钙蛋白I(cardiacTroponin-I,cTnI)免疫荧光鉴定乳鼠心肌细胞，将miR-21重组慢病毒载体转染入心肌细胞中，应用免疫荧光法检测心肌细胞转染效率及qRT-PCR法检测转染后心肌细胞中miR-21的表达。于原代分离培养心肌细胞后第48h将miR-21重组慢病毒载体转染入心肌细胞中，转染24h后加入TNF-α(10ng/ml)持续作用24h以建立心肌细胞凋亡模型，应用Hoechst33342/PI及Annexin-FITC法检测各组心肌细胞凋亡率，以心肌细胞凋亡率及生存率作为心肌细胞凋亡的观察指标，观察miR-21对TNF-α诱导的心肌细胞凋亡的影响。应用qRT-PCR法检测各组心肌细胞中miR-21及PTEN mRNA的表达，Western blot法检测PTEN，磷酸化PTEN(pPTEN)，丝氨酸/苏氨酸激酶(serine/threonine kinase,AKT)，磷酸化AKT(pAKTser473、pAKTThr308)，FOXO3a，磷酸化FOXO3a(pFOXO3a)和FasL表达水平，数据均以均数±标准差表示。图像数据用SPSS12.0统计分析软件包做多组间单因素方差分析或t检验，P<0.05有统计学意义。结果：聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)鉴定及DNA测序表明，miR-21重组慢病毒表达载体构建成功。体外分离培养的乳鼠心肌细胞，细胞呈多形性，如三角形、梭形、多边形等，细胞伸出伪足相互接触交织成簇，逐渐形成细胞簇或细胞单层，呈放射状排列的同心圆状，搏动呈同步性，收缩明显而有力，形成所谓功能性合体细胞，搏动频率多在70-100次/分。免疫荧光结果显示90%以上的乳鼠心肌细胞表达cTnI，符合心肌细胞特征。将miR-21重组慢病毒载体转染入心肌细胞48h后，免疫荧光法显示95%的心肌细胞表达GFP，荧光最强；qRT-PCR结果显示心肌细胞的miR-21表达明显上调。原代培养心肌细胞第48h后将过表达miR-21的重组慢病毒载体转染入心肌细胞，转染24h后加入TNF-α(10ng/ml)持续作用24h以建立心肌细胞凋亡模型，应用Hoechst33342/PI及Annexin V-FITC法均显示TNF-α(10ng/ml)能明显增加心肌细胞凋亡率，miR-21能显著抑制TNF-α(10ng/ml)诱导的心肌细胞凋亡(P<0.05)。应用qRT-PCR法检测发现TNF-α能明显降低miR-21的表达而增加PTEN mRNA的表达，PTEN mRNA的表达变化趋势与miR-21的表达变化趋势相反，结果提示在基因水平上，PTEN可能为miR-21对TNF-α(10ng/ml)诱导的心肌细胞凋亡的影响中的靶基因之一。与正常心肌细胞组相比，转染了过表达miR-21的重组慢病毒载体的心肌细胞组中的PTEN表达下调(P<0.05)，pPTEN，pAKTser473，pFOXO3a和FasL的表达上调(P<0.05)，pAKTThr308的表达未见明显变化(P>0.05)；TNF-α(10ng/ml)处理过的心肌细胞组中的PTEN表达明显上调(P<0.05)，pPTEN，pAKTser473，pAKTThr308，pFOXO3a和FasL的表达更显著上调(P<0.05)；与TNF-α(10ng/ml)处理过的心肌细胞组相比，转染了过表达miR-21的重组慢病毒载体并同时用TNF-α(10ng/ml)处理过的心肌细胞组中的PTEN表达下调(P<0.05)， pPTEN， pAKTser473，pAKTThr308，pFOXO3a和FasL的表达下调(P<0.05)；总AKT、FOXO3a在各组间未见明显差异(P>0.05)。各组PTEN蛋白的表达变化趋势与PTEN mRNA的表达变化趋势一致，故表明在蛋白分子水平上，PTEN可能为miR-21对TNF-α(10ng/ml)诱导的心肌细胞凋亡的影响中的靶基因之一。结果提示pPTEN，pAKTser473，pFOXO3a和FasL的表达的变化趋势一致，表明PTEN/AKT/FOXO3a通路可能能介导miR-21对TNF-α(10ng/ml)诱导的心肌细胞凋亡的影响。结论：过表达miR-21重组慢病毒载体构建成功，miR-21能够抑制TNF-α诱导的心肌细胞凋亡，该作用可能是通过介导PTEN/AKT/FOXO3a信号转导通路来实现的，为miR-21未来诊断及治疗心血管疾病提供了新的靶点。