论文部分内容阅读
猫杯状病毒(Feline Calicivirus,FCV)是猫和其它猫科动物的重要病原体,属于杯状病毒科水疮性病毒属成员,其核酸为单股正链RNA分子,病毒无囊膜,只有一个血清型。FCV多感染一岁以下的幼猫,通常导致急性口腔和上呼吸道传染病,主要症状为口腔溃疡、鼻炎、结膜炎、上呼吸道感染、跛行等,高致病性毒株甚至能引起猫的全身性感染,并导致死亡。目前,FCV的诊断方法主要有RT-PCR、免疫荧光技术、中和试验、琼脂扩散试验、夹心ELISA和间接ELISA,但是目前国内尚没有商品化的ELISA试剂盒。间接ELISA诊断方法能为FCV感染提供准确诊断,且具有简单、快速、灵敏性高等优势,对该病的流行病学调查、监测以及防控具有重要意义。VP1蛋白是FCV的主要结构蛋白,分为A、B、C、D、E、F六个区域,含有多个抗原表位。为了明确FCV VP1蛋白的抗原性,获得理想的重组抗原。本研究利用分子生物学软件Protean对A、B、C、D、E、F六个区域进行抗原表位预测,并用Megalign软件分析其保守性;设计引物,RT-PCR扩增目的基因,进行了原核表达和Western Blot及血清学抗原性分析。Protean软件分析发现VP1基因的B区(125aa-397aa)、E区(426aa-524aa)、F区(524aa-668aa)均具有较高的抗原性,而Megalign软件分析表明氨基酸保守性分别为B区(90.2%-100%)、E区(67.7%-100%)、F区(89%-100%),均相对保守。Western Blot证明VP1-B、VP1-E、VP1-F蛋白具有较好反应原性,进一步血清学抗原性分析证明VP1-F蛋白具有良好的抗原性。在确定了VP1-F蛋白具有良好抗原性的基础上,以此为包被抗原建立了FCV间接ELISA诊断方法。选择优势抗原VP1-F作为包被蛋白抗原,进行了反应条件优化,并确立了阴阳性临界值,对建立的间接ELISA方法进行特异性、重复性、敏感性评价,与血清中和试验和间接免疫荧光试验作比对,并对临床血清样品进行检测。结果表明,抗原VP1-F的最佳包被浓度为2μg/mL,最佳包被时间为37℃2h;待检血清最佳稀释度为1:100,最佳作用时间为37℃1h;最佳封闭液为5%脱脂乳,最佳封闭时间为37℃1h;二抗最佳稀释度为1:5000,最佳作用时间为37℃45min,底物最佳作用时间为4min。确立了阴阳性临界值0.352。建立的间接ELISA诊断方法对猫疱疹病毒阳性血清、猫细小病毒阳性血清、猫传染性腹膜炎病毒Ⅰ型阳性血清、猫传染性腹膜炎病毒Ⅱ型阳性血清均无交叉反应,特异性良好。用同一批次和不同批次包被的酶标板检测质控血清,变异系数均小于10%,重复性良好。FCV的质控阳性血清稀释至1:3200仍显示为阳性,敏感性良好。与血清中和试验符合率为95%,与间接免疫荧光试验符合率为100%。用建立的间接ELISA诊断方法检测从哈尔滨花鸟鱼宠物市场采集到的60份猫血清样品,抗体阳性率为88.3%。综上所述,本研究对FCV VP1蛋白各区进行抗原表位预测和保守性分析。利用原核表达系统成功表达重组蛋白VP1-A、VP1-B、VP1-CD、VP1-E、VP1-F,对其进行Western Blot和血清学抗原性分析,获得优势抗原VP1-F蛋白,以VP1-F作为包被蛋白建立了具有良好的特异性、重复性、敏感性的间接ELISA诊断方法,为FCV的诊断和防控奠定了基础。