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研究背景与目的:胞外囊泡（Extracellular vesicles,EVs）是一种新近发现的细胞间物质和信息传递工具。病毒可利用EVs特殊的双层膜结构进行“藏匿”和运输,逃避宿主细胞的免疫识别,进而保护自身,并进行有效传播和扩散。发热伴血小板减少综合征（Severe fever with thrombocytopenia syndrome,SFTS）是一种新发蜱媒病毒性传染病,以发热、血小板减少等临床症状和较高的死亡率等特点,在我国、日本、韩国、泰国等亚洲国家地区广泛流行,造成严重的公共卫生安全问题。鉴于目前针对SFTS的疫苗和治疗药物尚未获批上市,阻断传播已成为有效控制SFTS流行危害的主要途径。研究发现,SFTS的病原体——发热伴血小板减少综合征病毒（Severe fever with thrombocytopenia syndrome Virus,SFTSV）的非结构蛋白（NSs）同宿主细胞EVs赖以生成的囊泡系统关系密切,且SFTSV内涵体的发生方式与细胞中EVs的内体生成途径十分相似。SFTSV通过劫持EVs生成途径进行细胞间扩散,进而系统感染的可能性极大。因而,本文从SFTSV劫持EVs生成途径进行传播的科学假说入手,通过SFTSV感染后宿主细胞分泌的胞外囊泡的分离、鉴定和感染及阻断实验,明确EVs在SFTSV胞间扩散和感染传播中的地位和作用,揭示SFTSV适应多种宿主细胞的分子机制,进而为有针对性的传播阻断防控技术提供理论基础和技术支持。本研究为科学解读SFTSV跨物种适应传播机制提供理论基础,也为建立科学、高效的传播阻断型SFTSV防控策略提供技术方案。研究内容和方法:1.建立SFTSV-EVs分离技术并完成其感染性验证通过多次差速超速离心,获得含有SFTSV的胞外囊泡（SFTSV-EVs）,并利用q RT-PCR、Western Blot和病毒空斑实验验证SFTSV-EVs内有SFTSV的感染性RNA及蛋白,且具有感染性。明确SFTSV感染性RNA及蛋白可以被包裹进EVs,建立从具有游离SFTSV的细胞培养液中分离SFTSV-EVs,并且证实SFTSV-EVs具有感染性。2.Vero细胞感染SFTSV前后分泌的EVs转录组分析对病毒感染前后Vero细胞分泌的EVs转录组测序,分析EVs介导SFTSV的特异性功能RNA,明确介导SFTSV胞间传播EVs的调控特点。3.SFTSV-EVs对不同宿主细胞的感染特征通过荧光示踪实验及感染非洲绿猴肾细胞、人成角质表皮细胞、人脐静脉内皮细胞、人胚胎肾细胞、小鼠树突状细胞,分析SFTSV-EVs的感染动力及对不同宿主细胞的感染特征。4.基于EVs的SFTSV传播阻断实验通过对EVs合成或分泌的阻断,研究GW4869及Pitstop2抑制SFTSV的感染传播的效果,明确SFTSV依赖网格蛋白受体和非依赖受体的传播特征。结果:1.通过多次差速超速离心可以将EVs与游离病毒分离,获得的SFTSV-EVs中包含SFTSV感染性RNA和核衣壳蛋白,并具有较高的病毒滴度。2.EVs转录组测序共鉴定出22个miRNA差异表达基因（DEGs）和645个LncRNA差异表达基因（DEGs）。其中,有11个miRNA和12个LncRNA DEGs在感染SFTSV后上调,11个miRNA和633个LncRNA DEGs在感染SFTSV后下调。DEGs主要富集在细胞和细胞组成、多泡体过程及核苷酸代谢、内质网中的蛋白质加工、脂质代谢、RNA转运、核糖体、mRNA监测和泛素介导的蛋白质水解等与EVs相关的代谢通路以及Toll、IMD、JAK/STAT等病原感染免疫通路。3.EVs能够促进SFTSV传播并感染其它宿主细胞,相比于游离的SFTSV,SFTSV-EVs能够在短时间内被邻近细胞所摄取并迅速增殖复制,并且能够感染不同宿主细胞,有助于扩大宿主谱。4.GW4869及Pitstop2通过抑制EVs合成/分泌及网格蛋白介导的宿主细胞内吞作用,抑制SFTSV的胞间传播。结论:本研究建立了SFTSV-EVs的分离方法,可以获得较高产量及纯度的SFTSV-EVs。Vero细胞感染SFTSV后分泌的EVs在转录水平发生显著变化,表明这些DEGs和通路参与EVs介导的SFTSV传播机制。证实了EVs介导SFTSV的胞间传播,EVs介导的SFTSV传播可使得SFTSV在短时间内实现大量复制增殖,传播速率明显高于游离SFTSV,并且具有广泛的宿主谱,揭示了EVs介导的SFTSV传播对多种宿主细胞适应的分子机制。GW4869处理影响了EVs介导的SFTSV的传播,这种非依赖受体的传播模式的确定是对SFTSV传播模式的完善和补充,为揭示蜱媒病毒传播机制、建立传播阻断型防控技术提供了理论依据和技术支持。