葡萄(Vitis spp.)是世界上栽培历史最悠久的果树之一,因其果实多汁且营养价值丰富而被广泛栽培。当前栽培的品种多为欧洲葡萄,欧洲葡萄品质优良,但是其抗病性较差,从而给葡萄产业带来不少的经济损失。因而挖掘葡萄抗病基因,开展抗病基因功能研究为解析抗病分子机理,定向改良感病葡萄抗病性具有重要的理论意义和应用价值。本研究以课题组前期发现的两个响应白粉病的抗病基因BAK1和LecRK1为基础,从欧洲葡萄‘无核白’中克隆其cDNA全长序列,利用先进的CRISPR/Cas9技术定向编辑BAK1和LecRK1,构建DNA编辑载体,通过农杆菌介导法将其转入‘无核白’胚性愈伤组织中,为深入开展抗病功能研究提供基础材料。本研究结果如下:1.VvBAK1和VvLecRK1基因及启动子克隆。采用RT-PCR技术克隆‘无核白’葡萄VvBAK1和VvLecRK1基因cDNA全长序列,VvBAK1开放阅读框为1833 bp,共编码610个氨基酸;VvLecRK1的开放阅读框为2415 bp,共编码804个氨基酸,VvLecRK1与欧洲葡萄‘黑比诺’的蛋白序列的同源性为97.77%,比‘黑比诺’的蛋白序列少了两个亮氨酸;从‘无核白’葡萄中克隆到了VvBAK1和VvLecRK1的启动子序列,分别为1566 bp和1583 bp。通过与葡萄基因组网站‘黑比诺’的序列比对,发现VvLecRK1的启动子序列少30 bp,并通过PlantCARE在线软件分析了两个基因的顺式作用元件。2.构建了VvBAK1和VvLecRK1的亚细胞定位载体,并瞬时转化本氏烟草细胞,通过激光共聚焦显微镜观察到绿色荧光均出现在细胞膜上,表明这两个基因都定位在细胞膜上。3.VvBAK1和VvLecRK1基因CRISPR/Cas9载体构建及葡萄遗传转化。利用‘无核白’的花药诱导出了胚性愈伤组织,构建了VvBAK1和VvLecRK1的四个靶点的CRISPR/Cas9的基因组编辑载体,通过农杆菌介导法转入‘无核白’葡萄的胚性愈伤组织中获得了部分抗性苗。对VvBAK1和VvLecRK1的转基因胚性愈伤组织进行鉴定,鉴定结果为:VvBAK1的四个靶点中,除第一靶点外,第二、第三、第四靶点出现多个碱基突变且有连续套峰。而VvLecRK1的四个靶点均未发生变化,也无套峰。表明VvBAK1打靶成功的可能性较大,而VvLecRK1则可能打靶失败。根据VvBAK1的突变效率,预计获得320-480株VvBAK1转基因抗性植株,其中阳性编辑植株90-140株。