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目的:乳腺癌(breast cancer,BC)是女性最常见的恶性肿瘤,其发病率位居女性恶性肿瘤的第1位。激素受体(hormone receptor,HR)阳性乳腺癌患者约占所有乳腺癌患者的三分之二,属于乳腺癌亚型中的激素敏感型。而雌激素受体(estrogen receptor,ER)介导的信号通路在其发生发展过程中起到重要作用,因此除化疗以外,内分泌治疗是其有效的治疗方式,他莫昔芬作为经典的抗雌激素药物,已经成为HR阳性乳腺癌患者的标准辅助用药。和其他类型的乳腺癌相比,HR阳性的乳腺癌患者预后较好,但是大部分死亡的乳腺癌患者还是HR阳性的,因其占比较大,而且存在原发性或继发性内分泌耐药,对他莫昔芬辅助治疗有反应的乳腺癌患者有三分之一最终将因内分泌耐药而复发。但是,HR阳性乳腺癌没有理想的预后指标,因此迫切需要发现新的生物标志物来进行预后分析,并有望成为治疗的靶点,甚至能够成为内分泌治疗的疗效预测指标。近年来,已经有研究发现内分泌耐药的机制之一是ER信号通路与细胞周期通路的串扰激活,CDK4/6抑制剂已经运用于临床上内分泌治疗进展性的患者。但是,关于细胞周期G1/S期的另一个重要的cyclin-CDK复合物,cyclinE-CDK2的研究却很少。而且有研究显示CDK4/6抑制剂耐药可能与cyclinE-CDK2的激活有关,但是ER阳性乳腺癌中内分泌耐药与cyclinE-CDK2的关系还不甚清楚。长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)是一类转录本长度超过200个核苷酸的RNA分子,结构上与mRNA相似,但它们并不编码蛋白质,而是以RNA的形式在多种层面上(表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等)调控基因的表达水平。来自乳腺癌患者的高通量测序数据表明,lncRNAs表达具有高度亚型特异性,对于ER阳性乳腺癌,雌激素(E2)激活的ER二聚体可以作为lncRNAs的转录因子,ER信号通路的激活对细胞增殖,分化与程序性死亡起到重要作用。而细胞内和细胞外途径与ER信号的串扰表明ER阳性乳腺癌的内分泌耐药发生在多个水平,例如细胞周期和PI3K/AKT/mTOR途径。在这种串扰中,lncRNA可能起到重要作用。然而,lncRNAs在细胞周期进程和他莫昔芬耐药方面的机制仍不清楚。所以,很有必要探索lncRNA在ER信号通路与CDK2调控的细胞周期串扰过程中发挥的调节作用。在这项研究中,我们进行了基于生存的GEO数据集的荟萃分析,并结合基因表达筛选出在ER阳性乳腺癌高表达且与预后不良显著相关的lncRNA MAFG-AS1,其受雌激素诱导并与转录因子ERα直接结合。现有研究显示,MAFG-AS1可以促进结肠癌与非小细胞肺癌的侵袭转移,但是在ER阳性乳腺癌中的作用机制还不甚清楚,是否与他莫昔芬耐药有关也值得我们进一步探索。本研究探讨了由MAFG-AS1/miR-339-5p/CDK2组成的ceRNA网络促进ER阳性乳腺癌增殖的机制以及证实了与他莫昔芬耐药的相关性。MAFG-AS1与CDK2介导的ER信号通路与细胞周期通路之间的串扰表明,MAFG-AS1可能是ER阳性乳腺癌的生物标志物和治疗靶标,而CDK2抑制剂则很可能用于内分泌耐药的治疗。总之,本文为ER阳性乳腺癌提供了新的预后标志物与治疗靶点,为内分泌耐药提供了新的研究方向。材料与方法:第一部分:1.利用GEO数据库中的6个乳腺癌数据集进行荟萃分析及Kaplan-Meier Plotter外部验证,同时在GEPIA在线数据库网站进行癌与癌旁的表达验证,筛选在luminal型乳腺癌中与总生存(overall survival,OS)/无复发生存(relapse-free survival,RFS)/无远处转移生存(distant metastasis free survival,DMFS)高风险显著相关的且在乳腺癌中高表达的目标lncRNA MAFG-AS1;2.收集乳腺癌术后新鲜的癌与癌旁的病理组织标本,利用qRT-PCR与原位杂交(in situ hybridization,ISH)检测乳腺癌组织与癌旁正常组织中MAFG-AS1的表达水平,利用Spearman相关分析计算MAFG-AS1的表达与乳腺癌临床病理参数的相关性;3.利用qRT-PCR检测MAFG-AS1在不同乳腺癌细胞系中与正常乳腺上皮细胞的表达水平;4.利用qRT-PCR检测雌激素作用于野生型与ER敲除型的ER阳性乳腺癌细胞后MAFG-AS1的表达水平;5.在Jaspar与PROMO数据库筛选MAFG-AS1启动子区的转录因子;6.利用染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,CHIP)验证雌激素作用后ERα与MAFG-AS1启动子区的结合情况;7.利用MTT和集落形成实验检测MAFG-AS1对ER阳性乳腺癌细胞增殖活力的影响;8.利用流式细胞仪检测MAFG-AS1对ER阳性乳腺癌细胞在细胞周期与凋亡方面的影响;9.利用雌性免疫缺陷小鼠进行敲减MAFG-AS1的慢病毒稳定转染后的原位成瘤实验;10.利用RNA核浆分离实验检测MAFG-AS1在ER阳性乳腺癌细胞中的核浆分布;11.在starbase在线数据库网站预测可能与MAFG-AS1结合的microRNAs,并在细胞水平进行qRT-PCR验证表达相关性;12.利用qRT-PCR验证miR-339-5p在乳腺癌与癌旁正常组织的表达水平,验证癌组织中miR-339-5p与MAFG-AS1的相关性;13.采用双荧光素酶报告基因实验及RIP实验验证MAFG-AS1与miR-339-5p的结合情况;14.利用MTT、集落形成和流式细胞仪检测细胞周期凋亡实验进行miR-339-5p与MAFG-AS1的挽救实验;15.利用starbase预测mi R-339-5p下游的靶基因,并在DAVID在线网站对靶基因进行通路富集;16.利用qRT-PCR验证CDK2在癌与癌旁的表达以及miR-339-5p与CDK2的相关性;17.采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-339-5p与CDK2的结合情况;18.利用MTT、集落形成和流式细胞仪检测细胞周期凋亡实验进行miR-339-5p与CDK2的挽救实验;19.利用免疫组化实验验证MAFG-AS1与CDK2、Ki-67的相关性;20.利用qRT-PCR和western blot检测MAFG-AS1、miR-339-5p与CDK2的ceRNA网络关系;21.利用western blot检测MAFG-AS1与CDK2及其他细胞周期相关因子的相关性,根据CDK2作用于FOXO1探索凋亡相关机制;22.利用qRT-PCR和western blot检测敲除MAFG-AS1后ERα的变化。第二部分:1.在Kaplan-Meier Plotter在线网站筛选他莫昔芬单药治疗的患者,分析MAFG-AS1的表达与生存的关系,进一步发现MAFG-AS1是否与他莫昔芬耐药有关;2.利用qRT-PCR检测MCF-7亲本细胞与MCF-7他莫昔芬耐药细胞中MAFG-AS1与ESR1的表达;3.利用qRT-PCR检测他莫昔芬作用12h,24h后MAFG-AS1的表达;4.利用MTT检测在MCF-7他莫昔芬耐药细胞中敲除MAFG-AS1后是否对他莫昔芬作用敏感;5.在Kaplan-Meier Plotter在线网站筛选他莫昔芬单药治疗的患者,分析CDK2的表达与生存的关系,进一步发现CDK2是否与他莫昔芬耐药有关;6.利用MTT检测在MCF-7他莫昔芬耐药细胞中敲除CDK2后是否对他莫昔芬作用敏感;7.在T47D细胞过表达MAFG-AS1探究其是否赋予了他莫昔芬耐药性;8.利用裸鼠皮下成瘤实验验证过表达MAFG-AS1后对他莫昔芬是否发生耐药性。结果:第一部分:1.通过生物信息学的方法筛选出在乳腺癌中高表达的且与luminal型乳腺癌不良预后相关的lncRNA MAFG-AS1;2.MAFG-AS1在乳腺癌组织中表达高于临近的正常组织,且MAFG-AS1高表达与乳腺癌肿块大小,ki-67显著相关;3.MAFG-AS1在乳腺癌细胞系中表达高于正常乳腺上皮,且在ER阳性乳腺癌细胞系表达较高;4.雌激素可以促进野生型ER阳性乳腺癌细胞中MAFG-AS1的表达,但在ER敲除后MAFG-AS1的变化没有统计学意义;5.两种在线数据库网站都预测到ERα是MAFG-AS1的转录因子;6.CHIP实验表明在雌激素作用后,ERα在MAFG-AS1启动子区的结合增多;7.MAFG-AS1可以促进ER阳性乳腺癌细胞的增殖作用;8.MAFG-AS1可以促进细胞周期G1/S期的转变,抑制凋亡;9.MAFG-AS1促进裸鼠体内原位成瘤作用;10.MAFG-AS1在ER阳性乳腺癌细胞中主要分布在细胞浆;11.经过筛选验证得到与MAFG-AS1吸附结合的miR-339-5p;12.miR-339-5p在乳腺癌组织中的表达水平显著低于临近正常乳腺组织,且与MAFG-AS1的表达呈负相关;13.双荧光素酶报告基因实验及RIP实验验证了MAFG-AS1与miR-339-5p结合;14.挽救实验结果表明过表达mi R-339-5p能够部分逆转过表达MAFG-AS1对ER阳性乳腺癌细胞带来的促进增殖与抑制凋亡作用;15.在线数据库预测与通路富集作用取交集得出CDK2为miR-339-5p的靶基因;16.CDK2在乳腺癌组织表达水平高于临近正常乳腺组织,且与miR-339-5p呈负相关;17.双荧光素酶报告基因实验证明miR-339-5p与CDK2结合;18.挽救实验结果表明敲除miR-339-5p能够部分逆转抑制CDK2对ER阳性乳腺癌细胞带来的抑制增殖与促进凋亡的作用;19.免疫组化证实高表达MAFG-AS1的样本,CDK2与ki-67表达也高;20.在m RNA与蛋白水平,过表达miR-339-5p能够逆转过表达MAFG-AS1带来的CDK2的增加;21.在mRNA与蛋白水平MAFG-AS1与CDK2呈正相关,在蛋白水平MAFG-AS1与cyclinE,Rb呈正相关以及CDK2调控的转录抑制因子FOXO1呈负相关,而与CDK4,CDK6和cyclinD1没有相关性。凋亡相关通路中MAFG-AS1与PARP,cl-caspase8,cl-caspase3呈负相关;22.mRNA与蛋白水平结果显示敲除MAFG-AS1后p-ERα的表达下调。第二部分:1.在他莫昔芬单药治疗的患者中,高表达MAFG-AS1与较差的DMFS和RFS有关;2.MAFG-AS1与ESR1在他莫昔芬耐药的MCF-7细胞中表达较亲本MCF-7细胞表达高;3.MAFG-AS1在他莫昔芬作用12小时表达下降,在24小时恢复到原水平;4.他莫昔芬耐药的MCF-7细胞中敲除MAFG-AS1后对他莫昔芬抑制细胞增殖的作用变敏感;5.在他莫昔芬单药治疗的患者中,高表达CDK2与较差的DMFS有关;6.他莫昔芬耐药的MCF-7细胞中敲除CDK2后对他莫昔芬抑制细胞增殖的作用变敏感;7.在T47D细胞过表达MAFG-AS1增加了他莫昔芬耐药性;8.过表达MAFG-AS1后增强了裸鼠原位成瘤的耐药性。结论:1.MAFG-AS1在ER阳性乳腺癌中高表达且高表达与不良预后显著相关。2.雌激素通过促进转录因子ERα与MAFG-AS1的结合诱导MAFG-AS1表达。3.MAFG-AS1通过miR-339-5p/CDK2的ceRNA网络促进ER阳性乳腺癌细胞的增殖和细胞周期G1/S期的转变,并且抑制细胞凋亡。4.由MAFG-AS1与CDK2介导的ER信号通路与细胞周期信号通路的串扰促进了ER阳性乳腺癌的他莫昔芬耐药。5.ERα-MAFG-AS1-CDK2-ERα形成的正反馈环路促进了ER阳性乳腺癌他莫昔芬耐药的发生。