颅脑创伤(traumatic brain injury,TBI)发生率、死亡率高,存活的患者多罹患残疾以及各种神经和精神性后遗症。TBI导致的严重后果很大程度上是由于受损脑组织难以进行自我修复所致,这也是TBI治疗的一个重点难点。一般而言,在组织创伤如表皮组织损伤后,修复性细胞如成纤维细胞大量增殖而填补创口实现完全性愈合。而在TBI后,发生增殖的细胞主要为支持性细胞如星形胶质细胞。损伤区域神经元大量损失,但其却难以由残存的神经元直接发生增殖而补充,修复性质的神经元一般来自非损伤区的新生未成熟神经元的迁移,但其再生数量却极为有限,远不足以弥补神经元的损失。另外,过度增生的星形胶质细胞和它分泌的细胞外基质构成胶质瘢痕,其阻碍新生神经元的迁移和神经元轴突的再生。此外,活化的小胶质细胞是TBI后介导炎症反应最主要的细胞,其分泌多种炎症因子参与神经炎症。神经元再生的不足,星形胶质细胞增生的过度,小胶质细胞活化导致的神经炎症均被认为是导致TBI后受损组织无法实现创口愈合的重要原因,如何干预以上因素从而有效地促进TBI后的组织修复,对TBI的治疗和预后具有重要的临床意义。c-Ski是鸟类病毒癌基因v-Ski的细胞内同源物,其分布于哺乳动物个体的多种器官和组织。其参与体内的多种病理生理进程,如成纤维细胞的增殖,肝脏和肌肉的再生,以及肿瘤的发生发展。我们前期研究发现c-Ski在皮肤损伤组织中表达增高,参与创伤愈合和瘢痕形成,也与早期伤口炎性细胞浸润,炎症因子白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)的分泌有关。但其是否在TBI后受损的脑组织中表达并发挥类似作用并不清楚。有报道指出,在中枢神经系统中,c-Ski参与神经发育过程中神经元的增殖,敲除ski基因可引起胚胎鼠神经发育缺陷,发育过程中增殖的神经元减少;在人类的1p36缺失综合征(其中ski基因缺失)也表现为发育缓慢、智力障碍等。另外,星形胶质细胞增生以及胶质瘢痕的形成是一种近似纤维化的反应,而c-Ski在多种纤维化反应及瘢痕形成中均起抑制作用。因此,我们推测c-Ski可能具有促进神经元产生,同时抑制星形胶质细胞增生及小胶质细胞的活化的作用,从而促进TBI后组织修复和功能的恢复。方法:我们借助中度TBI的小鼠模型对c-Ski在TBI损伤脑组织修复中的作用进行了研究:1.对小鼠TBI后28天内的损伤脑组织病理学变化及影像学改变、c-Ski水平变化及其细胞分布类型进行连续观察及分析,初步推测其作用。2.使用腺病毒转染的方法构建c-Ski过表达中度TBI小鼠模型,将小鼠分为c-Ski腺病毒处理组和对照病毒处理组,分析伤后28天内MRI影像3D重建组织缺损体积及神经行为学变化情况,明确其在TBI后受损脑组织修复及功能恢复中的作用。3.使用免疫荧光、Western blot、Elisa等方法观察c-Ski腺病毒处理组和对照病毒处理组小鼠损伤周围组织新生神经元、星形胶质细胞和细胞外基质的变化、小胶质细胞的活化状态,明确c-Ski促修复作用是否与其调节新生神经元的产生、星形胶质细胞增生和小胶质细胞活化有关。最后,将小鼠分为c-Ski si RNA处理组和对照si RNA组,使用si RNA干扰沉默c-Ski表达后观察上述指标,反向验证c-Ski在TBI后组织修复中的作用。实验结果:第一章:1.在中度TBI后1天,伤周组织出血、水肿、炎症反应剧烈,3天时开始消退;TBI后3天,组织缺损体积不明显,伤后7天组织缺损体积扩张显著,随后进一步扩大,在伤后28天形成巨大空洞。2.正常状态下脑组织中几无c-Ski表达,TBI后c-Ski水平上升,伤后3天达高峰,而后下降。升高的c-Ski表达于成熟神经元、新生未成熟神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞。3.TBI后组织缺损体积在伤后3天时相对较小,与c-Ski蛋白水平峰值的时间一致。而组织缺损体积在伤后7天开始持续扩大,此时c-Ski水平开始持续减少。结果提示,TBI后升高的c-Ski水平可能参与了组织修复,且其效应可能与其作用于神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞有关。第二章:1.通过在TBI损伤后伤周组织即刻一次性注射腺病毒的方法构建c-Ski过表达小鼠TBI模型,过表达的c-Ski在伤后7天达高峰,并持续表达至伤后28天;过表达的c-Ski分布于成熟神经元、新生未成熟神经元、星形胶质细胞及小胶质细胞。2.在病理学水平,H&E染色结果显示c-Ski过表达减轻了伤后3天、7天、14天、28天的组织缺损面积;在影像学水平,3D Slicer重建MRI影像结果显示,c-Ski过表达减轻了伤后7天、14天、28天的组织缺损空洞体积;在行为学水平,c-Ski过表达减轻了小鼠伤后3天、7天、14天的神经功能评分,在旷场实验中改善了小鼠伤后7天、14天、28天的运动能力,在旷场实验及高架十字迷宫中降低了小鼠伤后28天的焦虑水平。以上结果共同明确了c-Ski促进TBI后受损脑组织修复的作用。第三章:1.c-Ski过表达增加了TBI后3天、28天,小鼠伤周组织中残存成熟神经元数量,伤后7天未成熟神经元的数量及Edu阳性增殖的新生未成熟神经元数量,伤后14天Edu阳性增殖的新生成熟神经元数量,及伤后3天、7天伤周组织中DCX蛋白含量,表明过表达c-Ski促进了新生神经元的产生。2.c-Ski过表达减少了TBI后7天星形胶质细胞的数量及Edu阳性增殖的星形胶质细胞数量,伤后7天、14天伤周组织中GFAP及Laminin蛋白含量,伤后7天伤周组织中CSPGS的分布范围,表明过表达c-Ski抑制了星形胶质细胞增生。3.c-Ski过表达减少了TBI后1天、3天活化小胶质细胞的数量和IL-1β,TNF-α的含量,表明过表达c-Ski抑制了小胶质细胞的活化。4.沉默Ski基因后,TBI后3天、7天组织缺损体积增大,TBI后3天Edu阳性增殖的新生未成熟神经元数量减少同时Edu阳性增殖的星形胶质细胞数量增加,说明降低c-Ski水平不利于TBI后的组织修复,从而反向验证了我们的实验结果。结论:综上,我们的研究首次证实c-Ski是一个新的中枢神经系统损伤修复相关因子,提高c-Ski水平可以缩小TBI后损伤脑组织的缺损体积,促进TBI受损脑组织的修复和改善动物运动功能同时减轻焦虑情绪。这些作用与c-Ski促进新生神经元的产生进而增加损伤区域神经元的数量,并抑制星形胶质细胞增生以及小胶质细胞的活化有关。以上结果为以c-Ski为靶点促进TBI后受损脑组织修复,从而为治疗TBI以及脑卒中等多种中枢神经损伤提供了一个有前景的策略。