研究目的1.研究PAR-1对绒毛外滋养细胞sFlt-1表达的影响；2.研究氧化应激对滋养细胞sFlt-1表达的影响。研究方法1.PAR-1对滋养细胞sFlt-1表达的调控作用；1.1.人绒毛外滋养细胞传代细胞株HTR-8/Svneo (H8)细胞培养；1.2.PAR-1干扰质粒,过表达质粒分别转染H8细胞,分别设为空白对照组,抑制质粒组,过表达质粒组,在mRNA和蛋白水平检测细胞PAR-1表达；1.3.实时定量PCR (qRT-PCR)检测不同质粒转染后H8细胞sFlt-1, P1GF和VEGF mRNA表达；1.4.酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组细胞中sFlt-1, P1GF和VEGF蛋白表达。2.氧化应激对滋养细胞sFlt-1表达的调控作用2.1.使用二氯化钴(CoCl2)及依达拉奉(eda)处理H8细胞,分别设为空白对照组,缺氧组(CoCl2).治疗组(CoCl2+eda),治疗对照组(eda)4组,MTT实验检测H8细胞活力的变化；2.2.流式细胞术检测H8细胞内活性氧(ROS)的变化水平；2.3. qQT-PCR分别检测各组细胞sFlt-1, P1GF和VEGF mRNA表达；2.4. ELISA分别检测各组细胞sFlt-1, P1GF和VEGF蛋白表达。研究结果1.PAR-1对滋养细胞sFlt-1表达的调控作用1.1.荧光显微镜下可见转染后的H8细胞表现强绿色荧光信号,空白对照组无荧光信号表达,细胞转染效率较好；1.2.同空白对照组相比,过表达质粒组和抑制质粒组PAR-1mRNA表达分别为：570.60±19.2(P<0.05)和0.19±0.03(P<0.05)；蛋白表达分别为：1.89±0.20(P<0.05)和0.63+0.05(P<0.05)；1.3.与空白对照组相比,过表达质粒组,抑制质粒组细胞sFlt-1 mRNA水平分别为：2.60±0.26(P<0.05)和0.22±0.04(P<0.05),蛋白分泌分别为1.49±0.13(P<0.05)和0.52±.04(P<0.05)：1.4.同空白对照组比较,过表达质粒组,抑制质粒组P1GF mRNA表达分别为：0.61+0.13(P>0.05)和2.30±0.18(P<0.05),蛋白表达分别为：1.06±0.03(P>0.05)和1.11+0.04(P>0.05)；1.5.同空白对照组比较,过表达质粒组,抑制质粒组VEGF mRNA表达分别为：1.44±0.24(P>0.05)和2.67±0.45(P<0.05)；蛋白表达分别为：0.93±0.21(P>0.05)和2.08±0.05(P<0.05)。2.氧化应激对滋养细胞sFlt-1表达的调控作用2.1.与空白对照组比较,缺氧组细胞活性随药物浓度增大而逐渐下降(P<0.05),最适作用浓度为500μM；治疗对照组细胞活力无明显改变(P>0.05)；治疗组细胞活力较缺氧组相比,随药物浓度增加而逐渐增加,最佳治疗浓度为100μM(P<0.05)；2.2.与空白组比较,缺氧组ROS明显升高(2.41+0.27,P<0.05),治疗组和治疗对照组较缺氧组ROS显著降低(1.44±0.11,P<0.05)；2.3.与空白组相比,缺氧组sFlt-1mRNA(2.71±0.35,P<0.05)和蛋白(3.15±0.12,P<0.05)表达均显著增加,同缺氧组相比,治疗组和治疗对照组sFlt-lmRNA(1.22±0.12和1.12±0.17,P<0.05)和蛋白(1.33±0.04和1.255±0.05,P<0.05)表达均明显降低；2.4.缺氧组,治疗组,治疗对照组P1GF mRNA相对表达水平分别为：2.06±0.47,3.12±0.32，2.50±0.82(P>0.05)；缺氧组同空白组比较,稍增加P1GF蛋白表达(1.32±0.10,P>0.05),治疗组同缺氧组相比,P1GF蛋白分泌下降(0.93±0.04,P<0.05)：2.5.治疗组能显著促进H8细胞VEGF mRNA表达(5.61±1.05,P<0.05),明显高于缺氧组(2.36±0.68,P<0.05)；缺氧组,治疗组和治疗对照组VEGF蛋白分泌分别为：0.95±0.07,0.9±0.03,1.02±0.06(P>0.05)。结论1.上调PAR-1显著促进HTR-8/SVneo细胞sFlt-1表达,下调PAR-1可抑制细胞sFlt-1产生,表明PAR-1通路能够调控滋养细胞sFlt-1表达。2.氧化应激促进HTR-8/SVneo细胞sFlt-1表达,氧自由基清除可抑制氧化应激诱导的细胞sFlt-1的升高,表明氧化应激对滋养细胞sFlt-1表达具有调控作用。研究目的1.探讨PAR-1调控sFlt-1表达在胎盘血管新生和重铸中的作用2.探讨氧化应激对sFlt-1表达的影响,在胎盘血管新生和重铸中的作用。研究方法1.PAR-1调控sFlt-1表达在胎盘血管新生和重铸中的作用1.1. Hoechast33258染色观察过表达质粒和抑制质粒处理后H8细胞凋亡情况1.2. Western blotting检测各组细胞凋亡相关蛋白BAX和BCL2表达；1.3.细胞迁移实验检测各组细胞迁移能力的变化；1.4.细胞侵袭实验检测各组细胞侵袭能力的变化；1.5. qRT-PCR和ELISA实验分别检测各组细胞侵袭相关蛋白MMP2和TIMP2表达：1.6.管腔形成实验检测PAR-1调控sFlt-1表达对血管形成能力的影响1.7.共培养绒毛组织和蜕膜组织,观察PAR-1调控sFlt-1表达对子宫螺旋动脉重铸过程的影响。2.氧化应激调控sFlt-1表达在胎盘血管新生和重铸中的作用2.1.利用Hoechast33258染色观察CoCl2及eda作用后H8细胞凋亡情况；2.2. Western blotting检测各组细胞凋亡相关蛋白BAX和BCL2表达；2.3. Transwell细胞迁移实验检测各组细胞迁移功能的变化；2.4. Transwell细胞侵袭实验检测各组细胞侵袭能力的改变；2.5. qRT-PCR和ELISA实验分别检测各组细胞侵袭相关蛋白MMP2和TIMP2表达；2.6.小管形成实验检测氧化应激调控sFlt-1表达在血管形成中的作用；2.7.共培养绒毛组织和蜕膜组织,观察氧化应激调控sFlt-1表达对子宫螺旋动脉重铸过程的影响。研究结果1.PAR-1调控sFlt-1表达在胎盘血管新生和重铸中的作用1.1.同空白组相比,过表达质粒组细胞凋亡增强(246.8+15.3%,P<0.05),抑制质粒组对细胞凋亡无明显影响(121.4±14.8%,P>0.05)；1.2.同空白对照组相比,过表达质粒组明显促进BAX蛋白表达(1.29±08,P<0.05),抑制BCL2蛋白表达(0.79±0.05,P<0.05)；抑制质粒组明显下调BAX蛋白表达(0.7±0.03,P<0.05),上调BCL2蛋白表达(1.21±0.06,P<0.05)：1.3.同空白对照组相比,过表达质粒组显著抑制细胞迁移功能(32.7+7.1%,P<0.05),抑制质粒组显著促进了细胞迁移(156.9±23.4%,P<0.05)。；1.4.同空白对照组相比,过表达质粒组明显抑制细胞侵袭(46.1±4.4%,P<0.05)；抑制质粒组显著促进了细胞侵袭能力(121.0±7.5%,P<0.05)；1.5.同空白对照组比较,过表达质粒组抑制MMP2 mRNA(0.53±0.08,P<0.05)和蛋白(0.78+0.04,P<0.05)表达,促进TIMP2(1.61+0.17,1.53±0.05,P<0.05表达,抑制质粒组则显著增加MMP2 (1.90±0.17,1.20±0.06, P<0.05)表达,降低TIMP2产生(0.35+0.12,0.65±0.04,P<0.05)；1.6.同空白对照组相比,过表达组抑制了管腔形成能力(0.38±0.04,P<0.05),抑制质粒组促进了小管形成(1.28+0.09,P<0.05)：1.7.同空白对照组相比,过表达质粒组螺旋动脉重铸受抑制,动脉重铸减少,抑制质粒组动脉重铸得到改善。2.氧化应激调控sFlt-1表达在胎盘血管新生和重铸中的作用2.1.较空白组相比,缺氧组相对凋亡率为336.1±21.7%,(P<0.05),治疗组与缺氧组相比凋亡率降低(175.0±14.4%,P<0.05)；治疗对照组与空白组间差异无统计学意义(80.5±22.7%,P>0.05)。2.2.同空白对照组比较,缺氧组BAX表达升高(3.47±0.74, P<0.05), BCL2表达降低(0.58±0.08,P<0.05)：治疗组BAX蛋白表达为(0.88±0.02, P<0.05), BCL2蛋白表达为(1.38±0.12,P<0.05),治疗对照组BAX和BCL2表达分别为(0.86±0.03和1.07+0.06,P>0.05)。2.3.与空白对照组相比,缺氧组相对迁移率为30.0±5.6%,(P<0.05),治疗组相对迁移率明显高于缺氧组(100.1±7.5%,P<0.05),治疗对照组与空白组间无差异(122.9±7.6%,P>0.05)。2.4.与空白对照组相比,缺氧组相对侵袭率为12.8±3.6%,(P<0.05),治疗组相对侵袭率明显高于缺氧组(68.9±4.7%,P<0.05),治疗对照组与空白组间差异无统计学意义(111.5±17.3%,P>0.05)。2.5.同空白对照组比较,缺氧组MMP2 mRNA(0.28±0.05, P<0.05)和蛋白(0.73+0.05,P<0.05)表达降低,TIMP2蛋白(1.20±04,P<0.05)表达升高,治疗组相比缺氧组显著促进MMP2 (1.22±0.23,1.08±0.06, P<0.05)表达,抑制TIMP2产生(0.12±±0.04,0.71+0.05,P<0.05),治疗对照组MMP2表达为(1.41±0.21,1.12±05),TIMP2表达为(0.41+0.16,0.6±0.07)；2.6.同空白对照组相比,缺氧组官腔形成能力显著下降(0.55±0.10,P<0.05),治疗组促进了小管形成,显著高于同缺氧组(0.98±0.08,P<0.05),治疗对照组与空白组相比无差异(0.93±0.07,P>0.05)；2.7.同空白对照组相比,缺氧组螺旋动脉重铸显著受抑制,治疗组和治疗对照组动脉重铸相对增多。结论1.上调PAR-1诱导HTR-8/SVneo细胞凋亡,抑制滋养细胞迁移、侵袭及血管形成,阻碍子宫螺旋动脉重铸过程,下调PAR-1表达可明显增强细胞生物学功能及管腔样形成能力,改善螺旋动脉重铸障碍,提示PAR-1调控sFlt-1表达在胎盘血管新生和动脉重铸中可能具有正向调节作用；2.氧化应激促进HTR-8/SVneo细胞凋亡,抑制细胞迁移,侵袭和管腔生成,阻碍螺旋动脉重铸,氧自由基清除可明显改善氧化应激诱导细胞生物学功能,管腔形成及动脉重铸障碍,表明氧化应激调控sFlt-1表达在胎盘血管新生和动脉重铸中具有促进作用。研究目的1.通过shPAR-1胎盘局部转染,观察PAR-1体内调控sFlt-1表达对胎盘血管形成的影响；2.探讨体内给予氧自由基清除剂调控sFlt-1表达在改善胎盘血管形成中的作用。研究方法1.PAR-1体内调控sFlt-1表达改善子痫前期大鼠胎盘血管形成1.1.应用一氧化氮合酶抑制剂(L-NAME)建立子痫前期孕鼠模型；1.2.将18只孕鼠随机分为3组,治疗组孕鼠胎盘局部定位注射PAR-1的shPAR-1;1.3.转染后的胎盘行冰冻切片,荧光显微镜下观察荧光表达,qQT-PCR和Western blot定量检测PAR-1表达以验证转染效应；1.4.处死大鼠,收取胎盘,胎鼠,测量其大小,重量并记录；1.5.免疫组化染色(H&E和CD34)检测转染后胎盘组织内微血管密度。1.6. qQT-PCR检测转染后胎盘内sFlt-1, P1GF和VEGF表达；1.7.ELISA测定转染后孕鼠血清中sFlt-1, P1GF和VEGF的水平。2.氧自由基清除剂体内调控sFlt-1表达改善子痫前期大鼠胎盘血管形成2.1.通过L-NAME建立子痫前期孕鼠模型；2.2.将20只孕鼠随机分为4组,治疗组孕鼠eda腹腔给药；2.3.处死大鼠,收取胎盘,胎鼠,测量其大小,重量并记录；2.4.免疫组化染色(H&E和CD34)检测转染后孕鼠胎盘组织内微血管密度。2.5. qQT-PCR检测胎盘内sFlt-1, P1GF和VEGF表达；2.6. ELISA测定孕鼠血清中sFlt-1, P1GF和VEGF的水平。研究结果1.PAR-1体内调控sFlt-1表达改善子痫前期大鼠胎盘血管形成1.1.实验所用18只孕鼠,麻醉低温死亡一只,余孕鼠存活；转染于妊娠第16天进行,转染3天,于孕20天剖腹取胎鼠和胎盘组织；1.2.荧光显微镜下见胎盘组织内强绿色荧光表达,mRNA和蛋白表达显示治疗组胎盘内PAR-1表达明显受抑制,证实胎盘转染效率；1.3.孕17天前子痫前期和治疗组血管均逐渐升高(P<0.05),孕19天治疗组血压显著低于子痫前期组(P<0.05)；1.4.同空白对照组相比,子痫前期组胎盘内绒毛间质变窄,胎盘内微血管数目减少(53.33+4.26,P<0.05),治疗组较子痫前期组绒毛间质增宽,微血管密度增多(68.67+2.40,P<0.05)：1.5.同空白对照组相比,子痫前期组胎盘和胎鼠大小和重量明显降低(P<0.05),胎盘肉眼观较其他两组稍发白,同子痫前期组比较,治疗组胎盘、胎鼠得到显著改善(P>0.05)：1.6.同空白对照组比较,子痫前期组胎盘sFlt-1表达明显增高(1.87±0.12,P<0.05),治疗组胎盘sFlt-1表达较子痫前期组降低(1.01±0.14,P<0.05)；子痫前期组较空白对照组相比VEGF(0.44±0.05),PlGF(0.49±0.06)表达均降低(P<0.05),治疗组VEGF和PIGF表达增高(1.48±0.21和1.12±0.05,P>0.05)。1.7.同空白对照组比较,子痫前期孕鼠血清sFlt-1表达明显升高(2.02±0.03,P<0.05),VEGF和PIGF表达(0.73±0.01,0.60±0.04,P<0.05)均下降,治疗组相比子痫前期组sFlt-1表达下降(0.64±0.06,P<0.05),VEGF表达为(0.96±02,P>0.05),PLGF蛋白水平降低(0.77±0.04,P<0.05)。2.氧自由基清除剂体内调控sFlt-1表达改善子痫前期大鼠胎盘血管形成2.1.实验所需20只孕鼠,不明疾病死亡一只,余孕鼠存活；于妊娠16天开始,连续给药3天,孕20天后剖腹取胎盘和胎鼠；2.2.孕15天前子痫前期和治疗组血压逐渐升高(P<0.05),孕19天治疗组血压较子痫前期组明显下降(P<0.05)；2.3.同空白组相比,子痫前期组胎盘内绒毛间质变窄,微血管数减少(54.40±1.25,P<0.05),治疗组与子痫前期组相比绒毛间质增宽,胎盘内微血管数目相对增多(73.07±1.31,P<0.05),治疗对照组(76.80±3.22)与空白对照组间无统计学差异(P>0.05)。2.4.同空白对照组比较,子痫前期组胎盘和胎鼠大小和重量降低(P<0.05),治疗组胎盘及胎鼠较子痫前期组有所改善(P<0.05),治疗对照组与空白组相比无明显差异(P>0.05)；2.5.同空白对照组相比,子痫前期孕鼠胎盘中sFlt-1表达明显增加(1.86±0.14,P<0.05),VEGF(0.95±0.12,P>0.05)和PIGF(0.72±0.04,P<0.05)表达下降,治疗组sFlt-1表达较子痫前期组明显下降(1.12±0.12,P<0.05),VEGF(1.79±0.36)和PIGF(0.96±0.01)产生增加(P<0.05)：2.6.同空白对照组相比,子痫前期孕鼠血清中sFlt-1明显升高(3.42±0.19,P<0.05),VEGF(0.68±0.06)和PIGF(0.50±0.05)表达降低(P<0.05),治疗组血清中sFlt-1表达下降(1.37±0.03,P<0.05),VEGF(0.84±0.03)和PIGF(0.83±0.04)表达升高(P<0.05)。治疗对照组各蛋白表达与空白组无明显差异。结论1.沉默胎盘内PAR-1基因可有效降低sFlt-1的产生,并增强孕鼠胎盘血管生成能力,改善子痫前期孕鼠的不良妊娠结局,表明PAR-1调控sFlt-1表达在胎盘血管形成中具有重要作用,有望成为是治疗胎盘血管形成异常疾病的新的治疗靶点。2.给予氧自由基清除剂可有效抑制胎盘和血清中sFlt-1的产生,改善孕鼠胎盘血管形成能力及不良妊娠结局,表明氧化应激调控sFlt-1表达在改善胎盘血管发育障碍中可能具有重要作用。