转录因子NF-κB调节数以百计的基因转录,其功能涉及细胞存活、细胞增殖、炎症反应和癌症等。通过统计已报道的κb site(NF-κB binding site,NF-κB结合位点),NF-κB共识序列(consensus sequence)被推断为GGGRNNYYCC(N代表任何碱基,R代表嘌呤,Y代表嘧啶)。多种NF-κB的x射线晶体结构结果显示,p50结合于5’-GGGRN-3’,p65结合于5’-YYCC-3’,这与之前的统计结果一致。研究者通过使用SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)和PBM(protein-binding microarrays)验证了以上结论并对NF-κB可能的结合序列进行了扩展。其中,通过使用PBM,3285个潜在的κB sites与10种NF-κB二聚体的结合能力被系统分析,并相对定量以z-score值反映。在哺乳动物基因组中,DNA Cp G位点的C5甲基化是一种常见的影响基因转录的表观遗传调控方式。基因组中,部分区域的Cp G密度远高于其它区域,这部分区域被称为CGI(Cp G island,Cp G岛)。CGI大多位于基因启动子中,并且CGI很少发生甲基化。转录调控区域的CGI甲基化会明显抑制下游基因的转录。低Cp G密度的转录调控区发生的DNA甲基化对基因转录的影响目前还不是十分清晰,不过一般认为转录因子结合位点或其周围的Cp G发生甲基化会抑制转录因子的结合。然而,单一CGI的甲基化是否会影响基因的转录仍然是一个尚待研究的领域。已报道的与p65:p50二聚体结合的κB site大多符合NF-κB共识序列GGGRNNYYCC,但是反过来,基因组中的NF-κB共识序列却未必能够在NF-κB激活时加强下游基因转录。有时相邻的κb sites中某些可以但另一些不能同NF-κB结合,有时同样的κB site序列在某些位置有功能但在其它位置则无功能,这些发现提示,在NF-κB共识序列之外,还有其它因素(比如:κb sites的周围序列)影响NF-κB的结合或NF-κB结合后的功能。为探索有功能的κb sites周围碱基潜在的规律,我们从已发表的文献和数据库中挑选出人已明确结合位点且完全符合GGGRNNYYCC的κB sites,共计70个。我们分析了这70个κB site上下游各50 bp(base pair)范围内的碱基出现频率,发现κB site-1位置C碱基(-1C)出现频率明显低于其它碱基。我们最初猜测-1Cκb site较少的原因在于-1C可能会影响κb site的功能。因此我们使用报告基因分析,研究了CCL2(C-C motif chemokine ligand 2)κb site-1位置的T/C突变对下游基因的影响。结果显示-1C突变组的luciferase活力较野生型-1T组无明显改变,这提示-1位置T/C突变对κB site的功能无直接影响。NF-κB共识序列的第一个碱基是G,-1位置为C时可形成一处Cp G位点。-1C不影响NF-κB的功能,因此我们推测-1 Cp G(-1C与+1G组成的Cp G位点)的甲基化会抑制NF-κB与κB site的结合。为证明这个推测,我们进行了体外的DAPA(DNA affinity precipitation assay)。我们发现FABP6(fatty acid binding protein 6)κB site和CCL2κb site-1位置为me Cp G(methylated Cp G)时与p65、p50的结合能力较-1位置为Cp G或Ap G时明显降低,但-1位置为Cp G与Ap G则无明显差别。这提示κB site-1C并不影响NF-κB与κB site的结合,但是-1 Cp G的甲基化会抑制NF-κB与κB site的结合。为再次验证以上结论并且分析-1 Cp G的甲基化是否对κB site在细胞内的功能产生影响,我们使用报告基因分析检查了FABP6κB site和CCL2κb site-1Cp G甲基化对κb site功能的影响。我们发现κB site-1位置Wp G/me Cp G(W代表A或T)的突变明显降低了转染细胞受到TNFα(tumor necrosis factorα)处理后luciferase活力的增强倍数,然而κB site-1位置Wp G/Cp G的突变却对此无明显影响。这些结果提示κB site-1 Cp G的甲基化会抑制κB site的功能。通过RT-PCR(reverse transcription-PCR)实验,我们验证了在U937细胞中包含-1Cκb site的基因(-1C基因)也可以被NF-κB激活,提示-1CκB site可能处于低甲基化状态以维持其功能。因此我们通过BSP(bisulfite sequencing PCR)法检查了U937、8226和HEK 293T细胞中所有的六个-1CκB site周围Cp G的甲基化状态。结果显示,除U937细胞中的TFPI2(tissue factor pathway inhibitor 2)κB site和HEK 293T细胞中的IRF7(interferon regulatory factor 7)κB site以外,其它-1CκB site均处于低甲基化状态。这验证了-1CκB site需要处于低甲基化状态的猜测。并且我们发现所有的-1CκB site均位于CGI中,但是-1D(D指代A、T或G)κB site只有22%位于CGI中。这提示只有位于CGI中的-1CκB site才能在进化中保守存在。TFPI2和IRF7的κB site-1位碱基为C且处于CGI中,但BSP分析结果显示,U937细胞中TFPI2和HEK 293T细胞中IRF7的κB site周围甲基化状态很高。RT-PCR结果显示U937细胞中的TFPI2基因和HEK 293T细胞中的IRF7基因不能响应NF-κB的激活。但使用甲基转移酶抑制剂5-Aza-Cd R(5-Aza-2’-deoxycytidine)可恢复这两个基因对NF-κB激活的响应。这再一次证明了甲基化在NF-κB调控下游基因中的关键作用。因此,-1C甲基化提供了一种额外的调节下游基因转录的方式。部分κb site因为其序列的特点,可以与NF-κB有多种结合方式。因为NF-κB不同的结合方式,在我们的统计中有四个κb site-1位置可以为C可以为D。通过BSP实验我们发现-1C or D且不位于CGI中的FLRG(follistatin-related gene)κb site在U937和HEK 293T细胞中处于高甲基化状态。为判断多结合方式的κb site“-1 Cp G”甲基化是否会对NF-κB的结合产生影响,我们选择-1C or D的PTX3(pentraxin 3)κB site和FLRGκB site进行了DAPA实验。结果显示PTX3κb site与FLRGκb site的“-1 Cp G”的甲基化并不会抑制NF-κB的结合。进一步我们合成了排除了“-1C”结合方式的DNA,并以此进行DAPA实验,结果显示这种突变未降低或只在一定程度上降低了NF-κB的结合能力。这提示我们在“-1 Cp G”甲基化时,NF-κB可选择其它-1D的结合方式。DNA甲基化总是在DNA双链中对称出现。为探索-1 Cp G中哪条链的甲基化对NF-κB的结合影响更大,我们使用半甲基化的DNA进行了DAPA实验。结果显示-1C的甲基化显著地抑制了NF-κB与κB site的结合,但反向互补链+1C的甲基化对NF-κB与κB site的结合却几乎没有影响。前面的实验结果表明在大多数情况中,-1Cκb sites只有在CGI中才是有功能的。因此我们通过对多种脊椎动物中VCAM1(vascular cell adhesion molecule1)、CCL2和Rel B基因的启动子和增强中的κb site进行统计分析,来判断潜在的-1Cκb sites在进化中是否保守。我们发现在进化中,位于CGI中的κb site-1位置可以是任何碱基,然而不位于CGI中的κb site-1位置严格控制为非C。这也说明在进化中,-1Cκb site只有位于CGI中才可以保守存在。在本研究中,我们发现κb site的-1 Cp G的甲基化可以影响NF-κB与κb site的结合,从而影响κb site的功能。在κb site的-1 Cp G中,-1C的甲基化明显抑制了NF-κB的结合,而反向互补链+1C的甲基化所产生的作用却不明显。我们也发现对于多结合方式的κb sites,“-1 Cp G”的甲基化对NF-κB的结合无明显影响,这可能是因为“-1 Cp G”甲基化时,NF-κB可选择其它-1D的结合方式。为维持-1Cκb site的功能,在进化中只有位于CGI中的-1Cκb site才是保守的。我们的研究表明与κb site紧临的单个Cp G的甲基化可以为NF-κB下游基因的表达提供一种额外的调控机制。