目的手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)是一种由肠道病毒(Enterovirus)感染引发的疾病,通常导致患者发烧,同时在口腔、手和脚等部位发生溃疡或皮疹,一般具有自限性,但感染严重者可引起神经系统和全身并发症,如无菌性脑膜脑炎、心肌炎和肺水肿等,甚至导致死亡。2008年肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)感染在中国内地发生最大一次爆发,共造成490000例感染,126人死亡,之后EV71在整个亚太地区多次发生爆发式感染,已成为威胁婴幼儿健康的重大病毒传染性疾病。然而目前针对EV71治疗主要采用激素和对症治疗,并没有特效抗病毒药物,因此需进一步探究EV71的致病机制以及加快研发预防药物和治疗方法。EV71属于小核糖核酸病毒科肠道病毒属,是直径为20～30 nm的无包膜二十面体病毒颗粒,其基因组长度约为7.5 kb,包含4个结构蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)和7个非结构蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D)。结构蛋白VP1通过与宿主细胞表面的特异性受体结合促进病毒感染,受体有多种类型包括人类清道夫受体B2(Human scavenger receptor B2,h-SCARB2)、选择素糖蛋白配体(P-selectionglycoprotein ligand-1,PSGL-1)、膜联蛋白Ⅱ等,其中 h-SCARB2可更加有效地促进病毒感染。由于EV71针对不同种属宿主的易感性不同,研究者通过将h-SCARB2在不易感染的细胞或小鼠中过表达来促进感染。天然免疫是机体识别和抵抗病毒感染的第一道免疫防线,能够立即识别各种入侵病原体并有效地限制其感染,同时在适应性免疫的激活和效应过程中也起着重要作用。在宿主细胞内或表面广泛表达的病原分子模式识别受体(Pattern recognition receptors,PRRs)可快速有效地监测识别病原相关分子模式(Pathogen related molecular patterns,PAMPs),激活宿主天然免疫应答,诱导干扰素(Interferons,IFNs)和多种细胞因子如炎症因子等产生。IFNs主要包括Ⅰ型IFN、Ⅱ型IFN和Ⅲ型IFN三个家族。Ⅰ型IFN在哺乳动物细胞中广泛表达,针对多种细胞类型的病毒感染发挥关键的抗病毒作用。Ⅱ型IFN为IFN-γ,由激活的T细胞或NK细胞产生,具有免疫调节和抗病毒活性。Ⅲ型IFN包含IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3,与IFN-α/β具有很大的相似性,具有抗病毒功能。一旦EV71病毒侵入机体,Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)、维甲酸诱导基因-Ⅰ样受体(Retinoic acid-inducible gene-Ⅰ like receptors,RIG-Ⅰ)、黑色素瘤分化相关蛋白 5(Melanoma Differentiation-Associated protein 5,MDA5)等 PRRs 即可迅速识别 EV71 的 dsRNA成分,启动下游信号传导通路和级联反应,激活干扰素调节因子(Interferon regulatory factors,IRF)IRF-3 或 IRF-7 以及核因子 κB(Nuclear factorkappa-B,NF-κB),启动IFNs的转录翻译。产生的IFNs通过自分泌或者旁分泌方式与细胞膜上特异性受体结合诱导细胞产生大量干扰素刺激基因(Interferonstimulation genes,ISGs)等抗病毒蛋白发挥抗病毒功能。IFNs还具有免疫调节功能,如促进多种类型细胞上主要组织相容性复合物(Major histocompatibility complex classⅠ,MHCⅠ)的表达、促进树突细胞(Dendriticcells,DCs)表面共刺激分子的表达以及促进T细胞增殖等,从而激发适应性免疫的抗病毒功能。然而在EV71和宿主相互博弈的过程中,病毒进化出多种不同的机制逃逸机体的天然免疫监视和抗病毒功能,例如,EV71病毒的非结构蛋白2A和3C可通过抑制IFNs产生和应答阶段的多个关键环节和信号分子从而逃逸IFNs的抗病毒功能。2A蛋白能够剪切MDA5、3C蛋白能够阻断RIG-Ⅰ与线粒体抗病毒信号蛋白(Mitochondrial antiviral signaling protein,MAVS)的相互作用从而阻止 PRRs对入侵病毒的识别。2A蛋白能够剪切MDA5和RIG-Ⅰ下游的共同接头分子MAVS及TLR3下游的接头分子TRIF、3C蛋白能够剪切IRF7和IRF9阻碍IFNs和ISGs转录并剪切TAK1复合物中断下游信号过程。2A蛋白可通过下调IFNα/β干扰素受体IFNAR1的表达而抑制ISGs的转录。这些均为EV71能够逃逸机体天然免疫应答侵犯机体致病的主要原因。由于EV71属于肠道病毒,肠道是其主要的入侵门户,但是,至今为止,关于EV71如何逃脱、穿越关键的肠道粘膜天然免疫屏障而导致全身感染的机制尚缺乏探讨。肠道粘膜免疫屏障由致密排列的单层肠上皮细胞(Intestinal epithelia 1 cells,IECs)和分布在 IECs 间的肠上皮内淋巴细胞(Intestinal intraepithelial 1 ymphocytes,IELs)组成,构成肠道粘膜抵抗外来病原体感染的第一道防线。IE Cs含有TLR等多种PRRs,可直接识别肠腔内病原微生物成分,启动相关信号通路的活化,进而分泌干扰素、炎症趋化因子和多种细胞因子来直接抵抗外来病原体的感染。IELs含有胞浆颗粒且表达多种天然杀伤受体(Natural killer recept or,NKRs),其在IECs之间巡逻,能够及时识别被感染的IECs,发挥NK样杀伤活性和抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(Antibody dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC),从而对感染的细胞进行清除,在肠道免疫应答激活和粘膜免疫防御中发挥关键作用。肠道NK细胞分布于肠上皮细胞间隙和固有层中,亦是肠道粘膜免疫系统的重要成员,人类肠道NK细胞表达高水平的CD56、N KRs、CD16和TLRs,能够及时识别入侵肠道外来的致病性细菌和病毒,产生促炎因子如IFN-γ和TNF-α,杀伤感染的细胞、迅速清除感染的病原微生物,在对抗肠道细菌和病毒感染中起着必不可少的作用。有研究报道,肠上皮细胞间隙的NK细胞参与对肠道感染的人类获得性免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)的持久控制。因此,肠道IECs与分布于其间的IELs、NK细胞相互作用共同组成了维持肠道粘膜免疫稳态和抵抗外来病原体感染的第一道防线。然而,目前的研究多关注EV71对于各种天然免疫信号通路及其信号蛋白的影响,对于EV71是如何突破肠道粘膜免疫屏障从而进入全身引起神经系统和全身病变的机制以及肠道粘膜免疫屏障在抵抗EV71感染过程中发挥何种作用却很少有研究关注。本论文从肠道粘膜的角度,探讨EV71如何逃逸肠道粘膜屏障中IECs与天然淋巴细胞NK和IELs的识别与清除。首先成功构建了过表达h-SCARB2载体并且建立h-SCARB2-MC38细胞系,并验证h-SCARB2可显著促进鼠源细胞对EV71的易感性。接下来我们在建立EV71病毒感染体系的基础上,证实EV71(尤其是2A和3C蛋白)确实可抑制天然免疫相关信号通路的关键分子,可显著抑制多聚肌胞苷酸(Polyinosinic-polycytidylic acid,polyI:C)诱导的PRRs如RIG-Ⅰ、TLR3和MDA5的表达以及IFN-β的产生。为进一步观察EV71感染后肠道上皮细胞自身的天然免疫应答特点,本研究使用EV71感染来源于肠道上皮的结肠癌细胞系如HT29、CaCo2和HCT116,我们首先发现,EV71感染肠上皮细胞后IFN-β和IFN-λ的产生水平有明显差异,并且IECs对IFN-β和IFN-X的应答能力也不同,表现为IECs在EV71感染后产生IFN-λ的水平明显高于IFN-β,且肠上皮细胞对IFN-λ的应答更加强烈,以上现象表明IFN-λ在肠上皮细胞抗EV71感染过程中发挥更重要的作用。进一步我们发现EV71的2A或3C蛋白对IFN-λ的产生和应答发挥明显的抑制作用,提示此为EV71逃逸肠道粘膜免疫屏障的主要机制之一。接下来,我们还发现,EV71病毒蛋白2A或3C蛋白可显著抑制IECs表面NKG2DL的表达而促进感染的肠上皮细胞逃逸NK细胞或IELs的识别和杀伤。方法1.构建h-SCARB2载体并通过睡美人转座子系统建立h-SCARB2-MC38细胞系。通过噬斑实验和Q-PCR分别检测EV71感染MC38和h-SCARB2-MC38后上清液病毒滴度和细胞病毒载量及IFNs表达水平。2.以EV71-Human-BrCr毒株感染多种结肠癌细胞系HT29、CaCo2和HCT116,建立EV71感染肠上皮细胞系模型。3.以EV71-Human-BrCr毒株感染结肠癌细胞系HT29后,观察不同感染复数(Multiplicity of infection,MOI)、不同时间点细胞形态的变化,并通过噬斑实验和Q-PCR分别检测上清液的病毒滴度和细胞病毒载量以及Ⅰ型IFN、Ⅲ型IFN和ISGs的表达水平。4.采用Q-PCR检测polyI:C激活293T细胞后再转染EV71 2A和3C质粒对PRRs、IFNs以及ISGs表达水平的影响。5.采用流式细胞术和Q-PCR检测肠上皮细胞CaCo2、HCT1 16和HT29以及骨髓来源NK和T细胞IFN-λR和IFN-αR的基础表达水平,并进一步观察EV71感染和转染EV71 2A和3C质粒对细胞IFN-λR表达水平的影响。6.采用流式细胞术和Q-PCR检测EV71感染前后结肠癌细胞系HCT116细胞NKG2D配体MICA/B的表达水平,并观察polyI:C激活后再转染EV71 2A或3C质粒对NKG2DL表达水平的影响。7.采用CFSE/7AAD方法检测NK-92细胞对polyI:C激活或者基于polyI:C激活基础上再次转染EV71 2A质粒的HT29细胞对杀伤活性的变化。结果1.成功构建了h-SCARB2载体并建立h-SCARB2-MC38细胞系,发现过表达h-SCARB2可明显提高MC38细胞对EV71感染的敏感性,表现为EV71感染后h-SCARB2-MC38细胞上清液病毒滴度和细胞病毒载量及IFN-β和IFN-λ3的产生水平均明显高于MC38细胞。2.PolyI:C处理293T细胞可明显诱导PRRs如RIG-Ⅰ、TLR3和MDA5的表达以及IFN-β和ISGs的表达。而转染EV71 2A和3C质粒可明显削弱polyI:C的增强作用。3.以EV71-Human-BrCr毒株感染结肠癌细胞系HT29,从细胞病理状态、上清病毒滴度和细胞病毒载量等方面分析发现,随着MOI增加和感染时间延长HT29细胞病变程度逐渐加重,上清病毒滴度和细胞病毒载量逐渐升高,同时IFN-β、IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3的表达显著上调,且干扰素信号通路下游抗病毒蛋白MXA和ISG54等的表达也发生上调,并于48 h达到最高峰之后开始下降。4.EV71感染结肠癌细胞系HT29后,IFN-λ的表达水平显著高于IFN-β,在感染HT29 前外加 10 ng/ml IFN-β或 10 ng/ml IFN-λ1处理,可见 IFN-λ1 处理组较 IFN-β处理组更明显减轻病毒感染导致的细胞病变,上清液的病毒滴度亦明显降低。5.分别于EV71感染前、后给予结肠癌细胞外加10ng/m1 IFN-λ1处理,镜下观察细胞病变的程度,可见感染前予以IFN-λ1处理可明显减轻肠上皮细胞的病变程度,且上清液病毒滴度明显降低。而EV71感染后再外加IFN-λ1处理,可见大量细胞变圆脱落,且病毒滴度与EV71感染未予IFN-λ1处理组没有显著差别。6.EV71感染前外加IFN-λ1处理,明显增强肠上皮细胞ISG54、ISG15和PKR的表达,而EV71感染后外加IFN-λ1处理,则不能增强ISG54、ISG15和PKR的表达,与单纯EV71感染组水平相似。7.肠上皮细胞HCT116、HT29和CaCo2表面均高表达IFN-λR,而NK和T细胞等骨髓来源的细胞表面几乎不表达IFN-λR。8.PolyI:C刺激可显著上调IFN-λR表达,在此基础上过表达2A蛋白则显著抑制IFN-λR的表达。2A和3C蛋白均可显著抑制polyI:C诱导的IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3的表达及IFN-λ1诱导的ISGs的表达。9.EV71感染显著抑制肠上皮细胞NKG2D配体MICA/B的表达。2A和3C蛋白普遍抑制NKG2DL表达,尤其显著抑制MICA/B的表达。10.杀伤实验表明,经polyI:C刺激的HT29对NK92细胞的杀伤敏感性显著降低,pcDNA3.1+polyI:C刺激组与polyI:C刺激组的HT29对NK92细胞杀伤敏感性相似,pcDNA3.1-2A+polyI:C刺激组与pcDNA3.1+polyI:C刺激组相比,HT29对NK92细胞的杀伤敏感性显著降低。结论1.h-SCARB2受体可显著促进鼠源细胞对EV71感染的易感性且IFNs的产生水平显著提高。2.肠上皮细胞在EV71感染后产生IFN-λ的水平显著高于IFN-β,且肠上皮细胞对IFN-λ的应答更加强烈,表明IFN-λ在肠上皮细胞抗EV71感染过程中发挥重要作用。3.EV71病毒拮抗IFN-λ抗病毒功能,尤其是2A和3C蛋白对IFN-λ的产生和应答发挥明显的抑制作用,可抑制IFN-λ的产生水平、IFN-λR的膜表达水平以及IFN-λ下游ISGs的转录。4.EV71病毒2A或3C蛋白可显著抑制肠上皮细胞NKG2DL的表达而促进感染的肠上皮细胞逃逸NK细胞或IELs的识别和杀伤。