论文部分内容阅读
[背景与目的]
肺癌，作为我国乃至世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，近年来仍有逐渐增高的发病趋势。非小细胞肺癌约占全部肺癌的80％，早期诊断困难是其一个重要的特点，约七成的患者确诊时已失去了手术机会，肺癌的早期淋巴结转移是一个重要因素。Syk(the Spleen tyrosine kinase，Syk)是一种非受体酪氨酸激酶，长期大量的研究表明其不仅在所有造血细胞中表达，而且在诸如血管内皮细胞、鼻成纤维细胞、乳腺上皮细胞及胰腺上皮细胞等非造血细胞中也有广泛的表达。同时，在乳腺癌、胃癌、胰腺癌等多种恶性肿瘤的研究中，也发现了Syk的潜在抑制效应。还有进一步的研究证实:Syk在正常的乳腺组织、乳腺癌旁组织以及侵袭性乳腺癌组织中的表达程度逐渐降低，在高度侵袭性乳腺肿瘤中常检测不到其表达;在胃癌组织中运用RT-PCR法未检测到syk基因的表达;陈明霞等人运用类似的方法研究了胰腺癌组织，同时也得出了相似的结论。近年来实验证实血管内皮生长因子-C(vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C)也具有促进淋巴管生成作用，因此又称为淋巴管生成因子，VEGFR-3是其特异性受体，它们可促进早期淋巴管生成和肿瘤淋巴结的转移。现有学者推测，Syk相关信号通路可能通过影响淋巴管生成因子VEGF-C/VEGFR-3通路起作用，再从而抑制肿瘤淋巴管的生成。尽管肺癌甲基化方面的研究已经很多，但无论在Syk基因表达还是甲基化对其表达调控方面报道均较少，我们希望通过RT-PCR的方法检测Syk、VEGF-C在非小细胞肺癌组织、癌旁组织及正常肺组织的表达。通过本实验，我们拟探讨脾酪氨酸激酶(Syk)和血管内皮生长因子-C(VEGF-C)对非小细胞肺癌淋巴结转移的影响以及二者之间的潜在联系，达到对Syk与非小细胞肺癌关系初步研究的目的。
[材料与方法]
1.选取山东大学第二医院自2009年1月到2011年12月期间手术切除的非小细胞肺癌标本81例，标本包括非小细胞肺癌肺癌组织、癌旁组织和正常肺组织，常规石蜡包埋、切片，应用RT-PCR的方法，研究Syk、VEGF-C在非小细胞肺癌组织、癌旁组织和正常肺组织中的表达，并运用统计学分析，初步明确肺组织从正常到癌旁组织、肺癌组织的癌变过程中Syk与VEGF-C表达的相关性，并探讨不同年龄、性别、组织类型、分化程度及分期的非小细胞肺癌组织中Syk的表达是否有显著性差异。
2.细胞侵袭实验检测Syk、VEGF-C在非小细胞肺癌组织中的表达，并研究其潜在联系。
(1).构建携带人VEGF-C基因片段的真核表达载体pcDNA3.1-VEGF-C及含有Syk基因片段的真核表达载体pLNCXSyk;
(2).经脂质体介导转染人非小细胞肺癌细胞A549;
(3).筛选出稳定生长的细胞后，采用逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的方法分别检测 VEGF-CmRNA和Syk mRNA的表达;
(4).采用transwell小室法构建体外侵袭模型进行检测。
构建含人VEGF-C基因的真核表达载体，将其转染至人非小细胞肺癌细胞A549中，并设置空载组进行对照，用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的方法检测两组中VEGF-C的表达，取对数生长期各组细胞构建体外侵袭模型，计算侵袭细胞数目;同样方法处理Syk组。分析VEGF-C和Syk的表达与非小细胞肺癌淋巴结转移的相关性及二者之间的相互作用。
[实验结果]
1.非小细胞肺癌组织、癌旁组织及正常肺组织中Syk表达阳性率分别为4.9％，92.6％，100％，肺癌组织中Syk表达与正常肺组织中及癌旁组织Syk表达差异有统计学意义(P＜0.05)，癌组织中的表达低于正常组织中及癌旁组织;非小细胞肺癌组织、癌旁组织及正常肺组织中VEGF-C的表达阳性率分别为88.9％，12.3％，2.5％，肺癌组织中VEGF-C表达与正常肺组织及癌旁组织中VEGF-C表达有显著性差异(P＜0.05)，其表达高于正常肺组织及癌旁组织;正常肺组织及癌旁组织中VEGF-C的表达无显著性差异(p＞0.05); Syk与VEGF-C的表达呈现负相关（r=-1.000，P=0.000）;不同性别、年龄的患者，不同组织类型、分化程度及分期的患者其Syk表达差异无统计学意义(p＞0.05)。
2.RT-PCR扩增产物电泳证实，VEGF-C在转染组及空载组均有表达，细胞侵袭试验示转染组侵袭细胞数为50.29±7.56、空载组为20.143±1.51，差异有统计学意义(P＜0.05);RT-PCR扩增产物电泳表明Syk基因在转染组有表达，而空载组则没有表达，细胞侵袭试验示转染组侵袭细胞数为12.29±2.75、空载组为5±1.73，差异有统计学意义(P＜0.05)。
[实验结论]
1.非小细胞肺癌组织中Syk的表达显著降低，而VEGF-C的表达显著增高，两者表达呈现负相关。Syk的表达在非小细胞肺癌发生、发展过程中可能影响VEGF-C的表达从而发挥抑制作用。
2.不同性别、年龄的患者，不同组织类型、分化程度及分期的患者其Syk表达差异无统计学意义，但其差异是否具备临床意义，还需更大样本量实验或是其他实验手段探索验证。
3.Syk在非小细胞肺癌中不表达，Syk与VEGF-C在细胞内表达的增多与非小细胞肺癌的淋巴转移及其发生有潜在的联系。