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[背景]持续组织损伤和细胞死亡导致肝星状细胞（Hepatic Stellate Cells,HSCs）活化,细胞外基质（extracellular matrix,ECM）沉积引起纤维化,进一步可发展为肝硬化乃至肝癌。HSC活化是纤维化发生的核心事件。研究表明纤维化进展中部分蛋氨酸代谢酶表达异常,干预相关酶的表达有助于减轻肝损伤。蛋氨酸代谢在肝星状细胞活化方面的研究方兴未艾。自噬与蛋氨酸代谢水平密切相关,通常,自噬分解受损细胞器有利于细胞存活,但过度自噬会导致细胞死亡,利于细胞清除。天然活性成分在抗纤维化方面具有一定优势。实验室前期研究显示,来源于大蒜的天然活性成分二烯丙基三硫醚（Diallyl trisulfide,DATS）能够通过生成H2S减轻氧化应激导致的肝损伤。H2S作为蛋氨酸代谢的下游产物,其对于蛋氨酸代谢水平是否存在调控作用尚无报道。在此,我们从蛋氨酸代谢这一角度,深入探究DATS通过生成H2S诱导HSC自噬发挥抗纤维化作用的具体机制。[方法]1.体外研究体外实验选用人肝星状细胞系HSC-LX2。MTT法考察LX2活力;EdU掺入实验和台盼蓝染色检测细胞增殖及死亡;Western blot、Real-time PCR及免疫荧光考察纤维化指标及蛋氨酸代谢酶表达;HPLC检测蛋氨酸代谢物水平;试剂盒考察H2S生成;添加H2S生成抑制剂AOAA,Western blot、PCR、HPLC考察蛋氨酸代谢水平。改良的生物素转换法结合Western blot检测硫巯基化的H2S生成酶CBS的表达;CBS酶活性试剂盒考察酶活性;Western blot检测CBS降解;构建CBS siRNA,Western blot及HPLC考察代谢酶及代谢物水平;数据库预测结合点突变质粒转染考察硫巯基化位点。Western blot、免疫荧光、透射电镜、激光共聚焦考察自噬水平;PCR结合Western blot筛选自噬相关蛋白;台盼蓝染色考察添加自噬抑制剂或干扰自噬相关基因后,细胞死亡情况。添加SAM或AOAA,Western blot及激光共聚焦检测自噬。亚硫酸氢盐测序法（bisulfite sequencing PCR,BSP）检测自噬相关基因DNA甲基化水平;TCGA数据库分析组蛋白甲基化修饰酶与自噬相关基因的相关性;PCR筛选组蛋白甲基化及去甲基化酶表达;添加SAM,Western blot检测组蛋白甲基化情况;构建组蛋白去甲基化酶siRNA,Western blot、免疫荧光检测组蛋白甲基化水平及自噬相关蛋白表达;PI染色考察细胞死亡。添加自噬抑制剂或干扰自噬相关基因,Western blot及HPLC检测蛋氨酸代谢水平。2.体内研究选用经典的四氯化碳（carbon tetrachloride,CCl4）模型化学诱导小鼠肝纤维化。尾静脉注射VA-Lip-CBS shRNA以构建CBS敲减鼠。动物组别如下:阴性对照（NC）shRNA慢病毒,NC shRNA 慢病毒+CCl4;NC shRNA 慢病毒+CC14+DATS（40mg/kg）,NC shRNA慢病毒+CC14+GYY4137（50 mg/kg）,CBS shRNA 慢病毒+CCl4,CBS shRNA 慢病毒+CCl4+DATS（40mg/kg）。实验结束后,收集小鼠新鲜肝脏并计算肝重体重比;ELISA检测小鼠血清肝损伤及纤维化指标,蛋氨酸代谢物SAM及肝组织羟脯氨酸（hydroxyproline,HYP）水平;HE染色、天狼星红染色（Sirius red）及Masson染色,检测肝脏组织病理变化及肝脏胶原形成情况;免疫组化（immunohistochemistry,IHC）检测肝组织α-SMA;提取小鼠原代HSC,Western blot验证CBS体内干扰效率,以及CBS干扰后原代HSC自噬相关指标的变化;组织切片免疫荧光双染α-SMA和ATG7、α-SMA和CBS;Western blot检测组织匀浆中蛋氨酸代谢酶及自噬相关蛋白p62表达。[结果]1.DATS促进HSC死亡,抑制增殖活化,降低蛋氨酸代谢水平,恢复代谢或添加H2S生成抑制剂后细胞死亡减少。2.DATS通过硫巯基化修饰CBS增加其酶活性并抑制CBS降解,干扰或突变特定硫巯基化位点均可在一定程度上恢复蛋氨酸代谢。3.DATS诱导自噬,抑制自噬后HSC死亡减少,另外干扰ATG7后,DATS诱导自噬及HSC死亡的作用显著削弱。蛋氨酸代谢水平的恢复显著抑制ATG7的表达,并且能够有效遏制自噬流的发生。4.DATS上调ATG7与其显著上调KDM6A进而引起H3K27me3去甲基化有关,KDM6A的干扰显著降低自噬水平,蛋氨酸代谢恢复可抑制KDM6A表达。5.体内实验表明DATS或阳性药物GYY4137治疗的小鼠纤维化减轻,干扰CBS表达后,纤维化程度加剧。DATS能缓解CBS干扰后引起的损伤相关血清学指标的显著上调。CBS干扰的原代HSC中自噬水平显著抑制,给予DATS或GYY4137处理的小鼠血清SAM含量降低,而CBS的干扰能够恢复SAM水平,另外,Western blot结果显示,组织中蛋氨酸代谢酶含量在药物处理后显著下调,而CBS的干扰能够一定程度上恢复其表达。[结论]DATS促进HSC死亡抑制HSC活化增殖,主要通过生成H2S硫巯基化修饰CBS抑制蛋氨酸代谢发挥作用。DATS通过抑制蛋氨酸代谢诱导HSC自噬,上调的ATG7在其中发挥关键作用,并且其上调与低蛋氨酸代谢水平引起的组蛋白去甲基化密切相关。此外,增强的自噬流并不能挽救较低的蛋氨酸代谢水平。总之,DATS能够通过生成H2S硫巯基化修饰CBS抑制蛋氨酸代谢进而诱导自噬,明显改善小鼠纤维化及肝损伤。