赭曲霉甾体11α-羟化酶基因异源表达研究

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赭曲霉在工业上用于催化16α,17α-环氧黄体酮C11α-羟化反应,合成重要糖皮质激素类药物中间体C11α-羟基-16α,17α-环氧黄体酮。参与甾体C11α-羟基化反应的赭曲霉羟化酶为细胞色素P450酶。本课题首先在酿酒酵母中异源表达C1 1α-羟化酶基因AOH,结果表明AOH重组酵母细胞能够转化16α,17α-环氧黄体酮形成产物C1 1α-16α,17α-环氧黄体酮,说明AOH基因在酵母细胞中实现了功能表达。由于赭曲甾体C11α-羟化酶在工业上的价值,分析该酶的结构与功能的关系具有重要的意义。虽然AOH基因在酿酒酵母中成功获得表达,但其表达水平含量低,难以获得足够量的纯化C11α-羟化酶用于结晶及蛋白结构分析。通过TMHMM Server软件预测AOH基因的N端具有33氨基酸的跨膜区。为了增加C11α-羟化酶可溶性表达,对跨膜区域的33个氨基酸分别进行了 20、25和33氨基酸的截短删除。截短体AOH-33、AOH-25、AOH-20重组酵母都能够成功转化甾体底物,但对甾体底物16α,17α-环氧黄体酮的转化水平都低于AOH基因非截短体重组酵母。为了增加赭曲甾体C11α-拜化酶的表达水平,我们进一步尝试大肠杆菌表达体系。分别构建了完整AOH基因和截短体AOH-20、AOH-25、AOH-33相应的大肠杆菌表达载体,并获得了相应的重组菌。由于羟化酶必须和还原酶共同作用才能转化甾体底物,同时构建了赭曲AOR基因表达载体并获得了相应的大肠杆菌重组菌。以甾体底物16α,17a-环氧黄体酮来检测重组菌的甾体C11α羟化活性,未能观察到甾体C11α羟化产物积累。通过SDS-PAGE检测分析显示赭曲AOR还原酶以包涵体形式表达,而AOH及截短体AOH-33、AOH-25、AOH-20在大肠杆菌中未能实现表达。
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