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目的:白芷属于伞形科,为临床常用的中药之一。白芷被广泛用于各种类型的疼痛治疗中,尤其在头疼、牙痛及疮疡肿痛的治疗中应用较多,配合其他中药更可以用于缓解全身各部位疼痛病症。然而,对其镇痛的分子机制仍知之甚少。本课题旨在研究白芷水提液在急性疼痛和CFA诱导的炎症性疼痛小鼠模型中的镇痛作用及其基于TRPV1离子通道的作用机制,为白芷镇痛机制的研究及其临床应用提供新的思路。方法:(1)白芷水提液(Angelic dahurica extracts,ADE)的制备:取200 g的白芷,经过2次煎煮后,再经60℃旋蒸、抽滤、烘干后可得到白芷水提液冻干粉以备后续的实验研究。(2)将约8周大小的雄性小鼠(C57BL/6)随机分为4组(n=6),分别给予等体积的不同剂量ADE(20/100/600mg/kg)和蒸馏水灌胃,于给药前、给药后1、2、3、4、5小时对各组小鼠进行48℃水浴浸尾实验,记录各组小鼠5小时内甩尾潜伏期值。(3)将小鼠(C57BL/6)随机分为对照组(n=6)和ADE组(n=6),提前2小时分别给予蒸馏水和ADE(100mg/kg)灌胃,然后通过热辐射实验、Von-Frey实验以及冷刺激实验测得两组小鼠的热辐射缩足潜伏期(TWL)、机械性缩足阈值(MWT)和对冷刺激的甩尾潜伏期数据。(4)将小鼠(C57BL/6)随机分为对照组(n=6)和ADE组(n=6),实验前2小时分别给予蒸馏水和ADE(100mg/kg)灌胃,然后对2组小鼠右脚掌皮下注射辣椒素(500μM,10μL/只)致痛,录像并统计小鼠5分钟内的缩足次数和舔爪时间;如上同样对小鼠随机分为两组,提前2小时分别给予蒸馏水和ADE(100mg/kg)灌胃,对2组小鼠右脚掌皮下注射5%福尔马林(10μL/只)致炎性痛,录像并统计小鼠1小时内的缩足次数和舔爪时间。(5)选取Trpv1-/-小鼠及其同源野生型(WT,C57BL/6)小鼠,通过热刺激实验和辣椒素致痛实验,来观察两组小鼠同样给予蒸馏水和ADE(100mg/kg)灌胃前、后的行为学表现差异,研究ADE对Trpv1-/-小鼠痛阈的影响。(6)取小鼠(C57BL/6)的DRG神经元培养细胞,进行钙离子成像实验观察ADE对小鼠DRG神经元细胞对辣椒素反应敏感性的影响变化。(7)将60只小鼠(C57BL/6)随机分为4组(n=15):完全弗氏佐剂(CFA)诱导的炎症性疼痛模型组:CFA模型小鼠+蒸馏水(Distilled Water);双氯芬酸钠(Diclofenac)组:CFA 模型小鼠+Diclofenac(Diclofenac,10mg/kg/day);白芷水提液中剂量(ADE-M)组:CFA模型小鼠+ADE-M(ADE,100mg/kg/day);白芷水提液高剂量(ADE-H)组:CFA模型小鼠+ADE-H(ADE,600mg/kg/day)。在从造模当天直至造模结束的14天内,每天都对各组小鼠灌胃给药:分别给予等量等体积的蒸馏水或ADE或Diclofenac治疗。(8)建立模型后,通过Von-Frey实验、热辐射实验分别测试并分析4组小鼠的机械性缩足阈值(MWT)、热辐射缩足潜伏期(TWL)。(9)建立模型后第14天,取小鼠患侧腰4-6的DRG,采用钙成像实验观察各组小鼠DRG神经元细胞对辣椒素引起的Ca2+内流的不同反应,以评估各组小鼠TRPV1生理活性的变化。(10)通过免疫荧光染色、蛋白质免疫印迹(Western Blotting)实验检测并分析各组小鼠DRG(患侧L4-6)中TRPV1活性和表达的变化。结果:(1)用ADE(600mg/kg)灌胃给药后的1、2小时,小鼠的甩尾潜伏期与对照组相比都有显著性差异,这表明ADE能减轻小鼠对伤害性热刺激引起的敏感性。(2)给予ADE(100mg/kg)灌胃2小时后,小鼠对伤害性热刺激、冷刺激引起的敏感性明显降低。同时,ADE对于伤害性机械刺激引起的小鼠急性疼痛行为无明显影响。(3)ADE抑制了小鼠对于辣椒素和福尔马林诱导的疼痛行为,体现在ADE(100mg/kg)组小鼠对于辣椒素、福尔马林诱导的缩足次数和舔爪时间显著减少。(4)WT组小鼠在给予ADE(100mg/kg)灌胃前、后对伤害性热刺激和辣椒素引起的疼痛敏感性差异明显,而Trpv1-/-小鼠在给予ADE(100mg/kg)灌胃前、后对伤害性热刺激和辣椒素引起的疼痛敏感性无显著性差异。(5)当细胞给予ADE灌流(6 × 10-6 mg/μL)处理后,DRG神经元细胞对辣椒素(Cap)反应的比例(Cap+ADE,P<0.001)和荧光强度比(Cap+ADE,P<0.001)显著下降;再次洗脱后,DRG神经元细胞对辣椒素反应的比例和荧光强度比又回升。(6)给予CFA注射后的24小时到第14天内,与Con组小鼠相比,给予ADE(100/600mg/kg)治疗后的小鼠对CFA诱导的机械痛觉过敏显著降低,其镇痛效果明显优于Diclofenac组小鼠。同时,与Con组小鼠的TWL值相比较,给予CFA造模处理后2-14天间,ADE-M组、ADE-H组和Diclofenac组小鼠的TWL值都显著性上升。(7)钙成像实验结果显示:与Con组相比,Diclofenac、ADE-M和ADE-H组小鼠DRG中对辣椒素反应的细胞比例分别显著性降低了56.8%、47.3%、48.7%(P<0.001)。Diclofenac、ADE-M 和 ADE-H 组小鼠的 DRG 神经元细胞对辣椒素反应的荧光强度比与Con组相比也都显著下降(P<0.001)。(8)免疫荧光染色实验的结果表明:与Con组相比,Diclofenac、ADE-M和ADE-H组小鼠的DRG中TRPV1+神经元的比例显著性降低(Con,34.7%±1.5%;Diclofenac,28±1.3%;ADE-M,20.5±0.9%;ADE-H,26.7±1.5%;P<0.001)。(9)通过蛋白质免疫印迹实验检测了小鼠DRG中TRPV1蛋白的相对定量,我们发现ADE-M组、ADE-H组和Diclofenac组的数据与Con组数据相比较而言,都有明显下降;尤以ADE-M组小鼠的DRG中的TRPV1表达量下降最为明显(P<0.001)。结论:ADE能通过抑制DRG神经元中TRPV1的活性和表达缓解CFA诱导的小鼠炎症性疼痛,这至少在一定程度上解释了其镇痛作用及机制。ADE具有显著的镇痛作用,提示其可能成为一类新的治疗炎症性疼痛的重要药物。