前列腺癌是男性泌尿系统常见的恶性肿瘤。在北美地区男性恶性肿瘤当中,前列腺癌的发病率最高并且死亡率仅次于肺癌。在我国,随着人口老龄化的加剧,生活方式的西化,前列腺癌的发病率和死亡率呈逐年上升趋势,已成为威胁我国男性健康的主要疾病之一。前列腺癌的具体病因尚不完全清楚。普遍认为前列腺癌的形成是一个多因素多阶段的过程。目前,前列腺癌根治性切除术是治疗局限性前列腺癌的主要手段,但是对于已发生转移或者术后复发的患者,通常采用内分泌治疗。研究表明,80%患者早期对雄激素剥夺治疗敏感,但是在18-30个月的中位时间后,几乎所有患者的病变都将逐渐发展为去势抵抗性前列腺癌(CRPC)。这一阶段的患者对于内分泌治疗以及放化疗均不敏感,病情变得难以控制并且更容易出现转移,进入了难以治愈的阶段,已成为晚期前列腺癌患者主要的死亡原因。因此,探讨前列腺癌的进展机制以及寻找新的分子生物治疗靶点,对于延缓前列腺癌的恶性进展以及提高晚期肿瘤患者的生存率具有重要意义。近年来,microRNA (miRNA)在肿瘤中起到的作用受到了越来越多的关注。miRNA是一种单链的非编码小分子RNA,由长度19-25个核苷酸构成。不同物种间的miRNA具有高度保守性,是调控基因表达的重要分子。成熟的miRNA通过碱基互补配对的方式与编码基因的mRNA3’非编码区(3’UTR),通过抑制转录起始或者降解mRNA的途径,在转录后水平抑制靶基因的表达。至今为止,已发现的miRNA有数种,调控了人类基因组中大约一半的编码基因,并且miRNA的表达水平异常或功能紊乱密切影响了细胞的增殖、分化和凋亡以及肿瘤的发生、发展。目前,越来越多的研究表明miRNA在前列腺癌的恶性进展中扮演着至关重要的作用。本课题组前期研究通过临床相关性研究分析在激素依赖性前列腺癌患者标本与去势抵抗性前列腺癌患者标本中表达显著差异的miRNA,其中miR-744在去势抵抗性前列腺癌中的显著高表达,miR-744是一个最近被确定的肿瘤相关基因,在头颈部相关肿瘤、多发性骨髓瘤、胃癌、肝癌、鼻咽癌、卵巢癌、乳腺癌以及胰腺癌的患者组织中均发现其表达水平的异常。然而,目前还未见关于miR-744在人前列腺癌中研究报道。基于这样的研究现状,本研究首先通过实时荧光定量PCR技术在前列腺癌的组织和细胞中验证miR-744的表达水平,并且通过miR-744表达失调的体内外功能实验,探讨miR-744在前列腺癌中的生物学功能。最后运用生物信息学和分子生物学相结合的手段以及结合荧光素酶报告基因实验,进一步探究miR-744在前列腺癌中发挥生物学功能的分子机制。为筛选前列腺癌的生物标志物以及今后寻找新的前列腺癌治疗靶点奠定坚实的理论基础。第一部分miR-744在前列腺癌组织中的差异表达研究目的:随着我国人口老龄化的加剧以及临床诊断技术的进步,前列腺癌的发病率及检出率呈逐年上升趋势。前列腺癌早期大多为激素依赖性前列腺癌(ADPC),雄激素剥夺治疗对大多数患者均有明显效果,但一般在经过14-30个月的中位时间后,几乎所有患者最终均转变为去势抵抗性前列腺癌(CRPC),这一阶段的患者对内分泌治疗以及放化疗均不敏感,进入了难以治愈的阶段,并且疾病的进展十分迅速。目前,分子生物学方面的研究在临床上已经成为发现、诊断、治疗前列腺癌恶性进展的热点。miRNA在转录后翻译水平调控编码基因的表达,影响细胞的增殖、凋亡、分化以及恶性肿瘤的发生、发展。研究方法:在前期研究中,课题组通过临床收集16例ADPC组织与12例CRPC组织在液氮中保存,取3例ADPC组织与3例CRPC组织进行miRNAs表达谱芯片检测分析。筛选差异表达的microRNA后,本部分研究通过实时荧光定量PCR (qRT-PCR)和原位杂交(ISH)分别在组织标本中予以验证。同时,下载美国纪念斯隆凯瑟琳癌症研究中心(Memorial Sloan Kettering Cancer Center, MSKCC)数据库中前列腺癌患者的miRNA表达基因芯片数据后,利用统计学的方法分析差异表达的miRNA在前列腺癌中的诊断作用以及与预后生化复发的关系。研究结果:前期miRNA表达谱芯片检测分析发现在ADPC与CRPC组织中存在显著差异表达的miRNA,其中miR-744在恶性程度较高的CRPC组织中较ADPC显著高表达。本部分研究并且通过qRT-PCR和ISH验证了 miR-744在不同前列腺癌组织标本中的差异表达(P<0.001)。同时,对MSKCC数据库中下载的前列腺癌患者资料进行二次分析,Kaplan-Meier分析结果显示在98例前列腺癌患者中,以中位数为截点将前列腺癌组分为miR-744高表达组和miR-744低表达组,miR-744高表达组的患者生化复发时间短(P<0.0001)。并且通过多因素COX回归分析得出miR-744是前列腺癌患者预后的独立危险因素。研究结论:通过上述研究结果我们发现miR-744在CRPC中的表达较ADPC中显著增高,随着前列腺癌的恶性进展而升高,提示miR-744能够用于诊断前列腺癌的恶性进展。第二部分miR744对前列腺癌细胞生物学功能的影响研究目的:前列腺癌的发生发展是一个多因素相互作用的复杂过程,涉及许多基因在不同时间节点的选择性表达。在第一部分中,我们通过前期miRNA芯片表达谱分析并结合qRT-PCR以及ISH检测验证了 miR-744在CRPC组织中表达与ADPC组织中相比显著升高,并且通过对国外数据库中结果分析后得出miR-744前列腺癌的预后密切相关。但miR-744在人前列腺癌中的具体作用尚无系统的相关功能实验验证报道。因此,miR-744是否参与了前列腺癌的恶性进展,在前列腺癌由激素依赖向趋势抵抗这一转化过程中又扮演了怎样的角色,在本部分研究中,我们通过体外细胞功能实验以及体内裸鼠皮下成瘤实验,探讨miR-744在激素依赖性前列腺癌细胞系以及去势抵抗性前列腺癌细胞系中对细胞凋亡比例、细胞增殖能力、细胞迁移和侵袭能力以及裸鼠活体皮下成瘤能力的影响。研究方法:在激素依赖性前列腺癌细胞系(LNCAP)以及去势抵抗性前列腺癌细胞系(PC3和DU145)中采用qRT-PCR实验检测miR-744的表达量。并且通过体外功能实验在LNCAP、DU145和PC3细胞中分别过表达与干扰miR-744表达后,通过MTT和低密度细胞集落形成实验检测miR-744对前列腺癌细胞增殖能力的影响;流式细胞技术检测miR-744对前列腺癌细胞凋亡能力的影响;Transwell小室实验检测miR-744对前列腺癌细胞侵袭和迁移能力的影响。体内实验采用裸鼠皮下成瘤实验进一步验证miR-744对不同前列腺癌细胞系(LNCAP和PC3)体内成瘤能力的影响,并通过ISH和免疫组化(IHC)检测各组移植瘤体标本中miR-744以及Ki-67、CD31/34、Caspase-3等增殖凋亡以及血管生成相关基因的表达,进一步佐证miR-744对前列腺癌细胞增殖以及侵袭转移能力的影响。研究结果:qRT-PCR实验结果表明DU145和PC3细胞中的miR-744表达水平与LNCAP细胞相比显著升高(P<0.01)。MTT实验和低密度细胞集落形成实验结果均表明在miR-744表达量相对较低的LNCAP细胞中过表达miR-744后较对照组(NC组)相比能够显著促进细胞的增殖能力(P<0.05)。流式细胞仪检测结果发现过表达miR-744组与NC组相比能够显著降低LNCAP细胞凋亡的比例(P<0.05)。在Transwell小室实验中,过表达miR-744后能够明显促进LNCAP细胞的侵袭和迁移能力(P<0.05)。裸鼠皮下成瘤实验表明,过表达miR-744组的细胞瘤体大小和体积明显大于对照组(P<0.05),同时在皮下移植瘤体的病理切片中,免疫组化实验结果表明细胞增殖相关基因Ki-67的表达显著升高。同时,在miR-744表达量相对较高的DU145和PC3细胞中干扰miR-744的表达后,通过MTT实验和低密度细胞集落形成实验检测发现miR-744低表达组中的细胞增殖能力相较NC组显著降低。流式细胞仪检测结果表明干扰miR-744表达后,DU145和PC3细胞凋亡的比例与NC组相比明显升高。Transwell小室实验检测后发现,低表达miR-744后,DU145和PC3细胞的侵袭和迁移能力与NC组相比受到明显的抑制。裸鼠皮下成瘤实验表明,干扰miR-744表达组的细胞瘤体大小和体积明显小于对照组(P<0.05),同时在皮下移植瘤体的病理切片中,免疫组化实验结果表明细胞增殖相关基因Ki-67、血管生成影响因子CD31、CD34的表达均显著降低,细胞凋亡相关基因caspase-3的表达明显升高。研究结论:以上研究结果表明miR-744的高表达能够促进前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,并抑制细胞凋亡。相反的,干扰miR-744表达后,前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力受到明显的抑制,细胞的凋亡比例升高。由此可以得出结论,miR-744在前列腺癌中发挥了促癌基因的作用。第三部分miR-744靶向NKD1激活WNT/β-catenin信号通路研究目的:从第二部分的体内和体外实验结果中我们发现miR-744的表达失调可以影响前列腺癌细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭能力,发挥促癌基因的作用。但是miR-744发挥作用的机制目前尚未清楚。如上文所述,miRNA通过碱基互补配对的方式与靶基因mRNA的3’UTR区域结合,降解mRNA或抑制mRNA的翻译。因此,在明确了 miR-744的生物学特性之后,我们将着重探讨miR-744发挥功能作用的分子生物学机制。研究方法:通过昂飞(Affymetrix)人类全基因组表达谱芯片技术结合miRNA靶基因预测分析软件(miRNADA、TargetScan、RNA22-HSA),我们发现裸角质蛋白同系物1 (NKD1)是miR-744在前列腺癌中的潜在靶基因,并且在细胞内采用荧光素酶报告基因实验以及Western Blot实验,以及在人前列腺癌和裸鼠皮下瘤体组织的标本内利用ISH和IHC实验同时验证miR-744和NKD1之间的表达关系。通过KEGG通路分析芯片结果后发现miR-744表达失调后,WNT/β-catenin信号通路上的关键负向调控因子NKD1、GSK3β、SFRP1和TLE3在miR-744失调后均发生显著差异表达,这表明miR-744在前列腺癌中可能通过调控WNT/β-catenin信号通路发挥其促进基因的作用,并且通过TOP/FOP实验予以验证。最后,我们通过功能学回复实验,在细胞中进一步验证miR-744对前列腺癌细胞增殖和侵袭的生物学功能是通过调控NKD1来实现的。研究结果:荧光素酶报告基因实验以及Western Blotting实验研究结果均表明miR-744可直接与NKD1的3’UTR区域结合,抑制了 NKD1蛋白的表达(P<0.05)。ISH以及IHC实验结果发现在人体前列腺癌组织切片中以及裸鼠原位皮下移植瘤体组织切片中,miR-744与NKD1的表达呈显著负相关。TOP/FOP实验结果表明miR-744的表达失调能够通过调控NKD1从而影响WNT/β-catenin信号通路的激活(P<0.05)。通过功能学回复实验,我们发现共转染miR-744干扰片段和NKD1干扰质粒后,细胞的增殖和侵袭能力相比较只干扰了 miR-744表达的实验组而言显著升高。上述实验更进一步验证了 miR-744与NKD1之间的靶向调控关系。研究结论:NKD1是miR-744的直接靶基因,miR-744靶向NKD1激活了 WNT/β-catenin信号通路,并且miR-744对前列腺癌生物学功能的影响是通过调控NKD1实现的。第四部分NKD1在前列腺癌中的功能学研究研究目的:在第三部分中,我们已经证实了 miR-744在前列腺癌中可以直接靶向抑制NKD1的表达,并且通过抑制NKD1激活了 WNT/β-catenin信号通路,同时也进一步验证了 miR-744对前列腺癌生物学功能的影响是通过调控NKD1实现的。并且通过IHC实验结果检发现NKD1在CRPC组织标本中的表达相对于ADPC显著降低。目前关于NKD1在前列腺癌细胞中的表达情况以及其发挥的生物学功能还尚未见报道。因此,我们有必要检测NKD1在前列腺癌细胞中的表达情况,并且进一步探究在前列腺癌中NKD1发挥的生物学功能。研究方法:在前列腺癌细胞系LNCAP、DU145和PC3中采用Western Blotting实验检测NKD1的差异表达。并且构建NKD1的过表达以及干扰质粒,通过MTT和低密度细胞集落形成实验检测NKD1对前列腺癌细胞增殖能力的影响;Transwell小室实验检测NKD1对前列腺癌细胞侵袭能力的影响。研究结果:qRT-PCR和Western Blotting实验结果表明DU145和PC3细胞中的NKD1表达水平与LNCAP细胞相比显著降低(P<0.01)。MTT实验和低密度细胞集落形成实验结果均表明在NKD1表达量相对较高的LNCAP细胞中干扰NKD1表达后较对照组(NC组)相比能够显著促进细胞的增殖能力(P<0.05)。在Transwell小室实验中,干扰NKD1表达后能够明显促进LNCAP细胞的侵袭和迁移能力(P<0.05)。同时,在NKD1表达量相对较低的DU145和PC3细胞中过表达NKD1后,通过MTT实验和低密度细胞集落形成实验检测发现NKD1过表达组中的细胞增殖能力相较NC组显著降低(P<0.05)。Transwell小室实验检测后发现,过表达NKD1后,DU145和PC3细胞的侵袭能力与NC组相比受到明显的抑制(P<0.05)。研究结论:以上研究结果表明NKD1在前列腺癌细胞中的表达呈显著差异,并且NKD1的表达失调对前列腺癌细胞产生了显著的影响,由此得出,NKD1在前列腺癌中发挥了抑癌基因的作用。